蓖麻毒素的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备预防或治疗蓖麻毒素中毒药物中的用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，更具体地，本发明专利技术公开了蓖麻毒素的功能表位YYYS和EXITH，其中X可以为任意氨基酸，与其分别特异性结合的单克隆抗体6C2和13G6的氨基酸序列及编码上述抗体的核甘酸序列。本发明专利技术还公开了上述抗体在制备预防或治疗蓖麻毒素中毒药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术公开了一种蛋白的功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备预防或治疗蓖麻毒素中毒药物的用途。
技术介绍
蓖麻毒素(Ricin)是从大戟科植物蓖麻的种子提取的一种核糖体灭活蛋白质，是自然界最毒的毒素之一，曾作为生物战剂引起生物恐怖，被列为B类生物战剂。利用蓖麻毒素进行恐怖袭击的可能方式包括在人群稠密的地方施放蓖麻毒素气溶胶或喷洒液体用 蓖麻毒素污染食物和水原；用注射器将蓖麻毒素液体刺入人体等。该毒素经呼吸道吸入、消化道摄入和肌肉注射均可致人中毒。吸入后经4 8h使呼吸道上皮坏死、充血、水肿，致间质性肺炎和肺水肿。摄入后使消化道、肝、脾和肾出血、坏死，局部注射则使组织坏死和相关淋巴结受累，主要死于肺水肿和ARDS。蓖麻毒素由A、B两条多肽链通过二硫键连接而成。它的毒性作用机理主要是抑制蛋白质的合成。毒素进入人体后，通过B链识别末端含半乳糖的受体的结合而定位到到细胞表面，促进毒素分子以内凹方式进入细胞，形成细胞内囊，随后整个毒素分子从细胞内囊进入细胞质，并在高尔基体或溶酶体内裂解，游离出A链，A链透过膜进入胞浆，发挥其N-糖苷酶的活性，催化28S rRNA在4324位脱去一个腺嘌呤，使核糖体60S (原核)或80S (真核)亚基失活，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞死亡。根据蓖麻毒素的作用机制，可以从抗体及小分子拮抗剂方面阻断蓖麻毒素发挥其毒性作用(Rainey GJ, Young JA (2004)Antitoxins novel strategies to target agentsof bioterrorism. Nat Rev Microbiol 2:721-726)。文献报道抗蓖麻毒素B链的抗体可以通过阻断蓖麻毒素与细胞表面半乳糖受体的结合，从而阻断蓖麻毒素进入细胞(Guo Jff,Shen BF, Feng JN et al(2005)A novel neutralizing monoclonal antibody againstcell-binding polypeptide of ricin. Hybridoma 24:263-266);抗蓖麻毒素 A 链的抗体能够通过与N-糖苷酶的活性位点特异结合，阻断蓖麻毒素A链的RNA酶的活性，防止其酶解RNA，进而阻止其发挥细胞毒性作用，故此可以作为良好的Ricin中毒后的解毒剂(Lemley PV, Amanatides P, Wright DC (1994)Identification and characterization ofa monoclonal antibody that neutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo.Hybridoma 13 :417_421 ；Massimo Maddaloni, Corrie Cooke, Royce Wilkinson, AudreyV.Stout, Leta Eng and Seth H. Pincus. Immunological Characteristics Associatedwith the Protective Efficacy of Antibodies to Ricin. 2004；J Tmmunol ； 172 ；6221-6228)。到目前为止，文献中提到的具有中和活性的Ricin抗体所识别的表位均处于A链或B链上相应的活性位点中。本专利技术所公开的抗蓖麻毒素A链单克隆抗体所识别的表位均处于A链的活性位点以外，但在体内外均有针对蓖麻毒素的中和保护作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是公开了蓖麻毒素的新的功能表位EXITH，其中X可以为任意氨基酸。本专利技术的另外一个目的是公开了蓖麻毒素的另一新功能表位YYYS。本专利技术还公开了与上述第一个功能表位特异性结合的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体。本专利技术还公开了与上述第二个功能表位特异性结合的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体。更具体的，本专利技术公开了与上述第一个功能表位特异性结合的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体6C2，其重链、轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID N0U SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 ;以及与上述第二个功能表位特异性结合的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体13G6的重链、轻链可变区核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5、SEQID NO :6和SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 ;重链恒定区均为小鼠IgGl，轻链恒定区均为小鼠k链，它们的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10。本专利技术的另外一个目的是公开了上述抗蓖麻毒素的单克隆抗体在制备预防或治疗蓖麻毒素中毒药物中的应用。具体地，本专利技术的申请人首先利用分子生物技术克隆蓖麻毒素A链基因，利用原核表达了蓖麻毒素A链蛋白，并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了一系列特异性抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体，其中尤其以抗体6C2为最佳，其次为13G6抗体，还对该两株单抗基因进行了克隆并测定了其序列。本专利技术的申请人利用非洲绿猴肾细胞株Vero进行了一系列实验，来验证本专利技术公开的鼠抗蓖麻毒素单克隆抗体6C2对细胞毒性的抑制作用。细胞毒性实验结果表明抗蓖麻毒素抗体6C2和13G6均可有效阻断蓖麻毒素对VeiO cell的细胞杀伤力，相应的，作为对照的单克隆抗体2D6则没有上述作用，从而说明了本专利技术公开的上述抗蓖麻毒素A链抗体6C2和13G6可有效抑制蓖麻毒素的细胞毒作用。本专利技术的申请人利用蓖麻毒素腹腔注射在小鼠体内建立了小鼠蓖麻毒素感染中毒的动物模型，并在该模型上验证了抗蓖麻毒素A链单克隆抗体6C2和13G6在体内也具有有效的预防毒素作用。除此之外，利用该模型本专利技术的申请人还验证了 6C2在体内具有有效的治疗蓖麻毒素中毒作用。本专利技术的申请人还利用噬菌体展示技术鉴定了抗体6C2和13G6作用的蓖麻毒素的功能表位，功能表位分别为EXITH和YYYS，进一步阐述了蓖麻毒素分子的作用靶点。更具体的，本专利技术的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、Phageclones ELISA鉴定测序及序列分析推测出蓖麻毒素A链的不同新功能表位，进一步通过定点突变原核表达突变体蛋白，通过体外酶学实验对这些功能性表位进行了鉴定。本专利技术公开的蓖麻毒素抗体可阻断Ricin发挥RNA酶活性，防止其酶解RNA，进而阻止其发挥细胞毒性作用，故此可以作为良好的Ricin中毒后的解毒剂。附图说明图I蓖麻毒素A链酶切链接PGEX-4T-2后的酶切电泳图，其中1_6泳道为6个不同的连接转化克隆的酶切结果，泳道7为空载体对照，M为DNA分子量marker ；图2蓖麻毒素A链原核诱导表达SDS-PAGE图，其中1_5泳道为5个不同克隆的诱导表达结果，M为蛋白质分子量marker ；图3蓖麻毒素A链纯化SDA-PAGE图，其中RTA-GST为蓖麻毒素A链与GST的融合蛋白，RTA为酶切去除GST后的纯蓖麻毒素A链；图4单克隆抗体6C2和13G6与RTA特异性结合曲线；图5Veix)细胞对蓖麻毒素敏感性曲线测定； 图6抗体保护VeiO细胞免受蓖麻毒素毒素攻击实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蓖麻毒素的功能表位EXITH，其中X可以为任意氨基酸。2.一种蓖麻毒素的功能表位YYYS。3.一种抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体，与权利要求I所述的功能表位特异性结合。4.一种抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体，与权利要求2所述的功能表位特异性结合。5.权利要求3所述的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体，为6C2，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :2，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :4，重链恒定区为小鼠IgGl，轻链恒定区为小鼠k链。6.权利要求4所述的抗蓖麻毒素A链的单克隆抗体，为13G6，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :6，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :8，重链恒定区为小鼠IgGl，轻链恒定区为小鼠k链。7.编...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建新，赵健，杨海鸥，赵磊，王华菁，郭亚军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：