一种绵羊可诱导多能干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种绵羊可诱导多能干细胞及其制备方法，该制备方法包括步骤：A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40、hTERT；B)采用步骤A)所得慢病毒载体将转录因子以组合形式感染绵羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到绵羊可诱导多能干细胞。本发明专利技术有助于确立绵羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；绵羊可诱导多能干细胞是绵羊基因打靶的良好载体，同时绵羊可诱导多能干细胞将利于揭示绵羊各基因功能和复杂的发育事件，并可用于改良物种、促进经济增长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种绵羊成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell，简称iPS细胞)及其制备方法。
技术介绍
绵羊是大型偶蹄目动物，其基因组、器官大小均与人类相近，而且在畜牧、农业方面的应用非常广泛，可以用于制造人类疾病模型；将其器官作为人类器官移植的供体；利用转基因技术制造药物蛋白；改良物种等等。胚胎干细胞是来自胚泡，可无限繁殖同时能维持多能性，即可分化为三个胚层的一类祖细胞。基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、发育生物学、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推动作用。从25年前小鼠胚胎干细胞获得到现在，人们利用反向遗传学手段不断建立和完善各种小鼠模型(Demers，S. P.，et al. (2007), Cloning andstem cells,9, 512-522) 0但数十年来科学界始终没能成功建立绵羊胚胎干细胞(ES)系。其中很重要的一个原因就是没有寻找到适合绵羊ESC全能性维持的培养基。此外，绵羊的胚胎发育过程以及维持绵羊ESCs全能性的通路研究都不够清楚；对于鉴定其干细胞特征的方法很有限，也是导致目前并没有产生绵羊ESC细胞系的原因，也就制约了转基因绵羊及克隆羊的应用。经典的建立ESC细胞系的方法是从囊胚的内细胞团分离出ESCsdfiWg前的研究结果来看，利用经典方法产生绵羊ESC细胞系是相当困难的。2006年8月，Yamanaka实验室利用外源表达0ct4, Sox2, c_Myc，Klf4四个转录因子，成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的“可诱导的多能干细胞”(inducedpluripotent stem cells，iPS)，这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转录因子诱导，重编程到全能性的状态(Takahashi, K.，and Yamanaka, S. (2006). Inductionof Pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors. Cell 126,663-676) ；2007 年，人类 iPS 的建立，进一步验证了该方法的可行性(Takahashi, K. , et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors. Celll31,861-872 ；Yu,J.,et al. (2007).Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science318，1917-1920)。但由于iPS细胞并非百分之百的ES细胞，是否能够运用到使用传统方法无法建立ES细胞的物种上还是未知的，现有技术中也未见报道”。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于，提供一种绵羊可诱导多能干细胞。本专利技术的第二个目的在于，提供一种绵羊可诱导多能干细胞的制备方法。本专利技术的绵羊可诱导多能干细胞的制备方法，包括步骤A)构建携带转录因子的药物诱导的慢病毒载体，即Tet-on系统。所述转录因子选自0ct4，Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28, Nanog, SV40, hTERT ；B)将步骤A所得慢病毒载体以组合形式感染绵羊成体细胞，同时加入Lv-efla-rtTA-IRES-EGFP，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到绵羊可诱导多能干细胞。根据本专利技术所述的方法，所述绵羊成体细胞为绵羊原代耳尖成纤维细胞。根据本专利技术所述的方法，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子的组合形式包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、SV40、hTERT ；或 0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Nanog、Lir^8、SV40。根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的传代培养是将绵羊iPS克隆按1 5 40的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。根据本专利技术所述的方法，还包括步骤C)绵羊iPS细胞的干细胞多能性鉴定。根据本专利技术所述的方法，所述步骤C)绵羊iPS细胞的干细胞多能性鉴定包括检测以下指标1)碱性磷酸酶表达呈阳性；2)干细胞表面特异标记 SSEA-I (+)、Tra-1-60 (+)、Tra-1-81 (+) Rexl (+)、CDHl(+)；3)自然分化形成胚状体后，外胚层Fibronectin (+)、NeuroD (+)、NFH(+)，中胚层ACTC1 (+)、KDR (+)、Myf5 (+)和内胚层 DCN (+)、AFP (+)、Foxa2 (+)；4)绵羊iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根据本专利技术所述的方法，所述形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。根据本专利技术所述的方法，所述干细胞多能性鉴定还包括检测5)Nanog基因的启动子区域被去甲基化。本专利技术有助于确立绵羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；绵羊iPS细胞是绵羊基因打靶的良好载体，本专利技术的绵羊iPS细胞将利于揭示绵羊各基因功能和复杂的发育事件；此外，绵羊iPS是继人、恒河猴的iPS成功诱导后大型哺乳动物的iPS，这对于其它模式动物iPS的诱导有着重大指导意义。附图说明图1是病毒载体LV-ef 1 α -EGFP-TRE结构图。图2是绵羊iPS细胞形态荧光镜检结果，此为经过筛选纯化后得到的稳定细胞系。图3是绵羊iPS细胞碱性磷酸酶活性检测。图4A为Realtime PCR检测绵羊iPS细胞未分化Marker表达情况的电泳图，图4B为内源0ct4，Sox2和Nanog的表达差异柱形图。使用的细胞系为绵羊耳尖成纤维细胞，绵羊 iPS 细胞系 oiPS7-3，7-12，8-3，8-18，8-60，8-64，8-108 及 8-119。图5是免疫荧光染色检测绵羊iPS细胞干细胞相关marker表达情况，包括SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81、Rexl 和 CDHl。标尺代表 25 μ m。图6是重亚硫酸盐基因组测序分析绵羊iPS细胞Nanog启动子区甲基化状态的结果。使用的细胞系为绵羊耳尖成纤维细胞，绵羊iPS细胞系oiPS7-3，7-12，8-108及8-119。图7检测绵羊iPS细胞在体外向三个胚层的分化能力。其中(A)为RealtimePCR检测拟胚体中分化marker的表达，使用的细胞系为oiPS7_12，8_64，8-108及8-119与其对应的拟胚体；(B)为免疫荧光染色检测绵羊iPS细胞拟胚体的分化marker，标尺代表50 μ m0图8为绵羊iPS细胞畸胎瘤形成情况，其中㈧神经上皮(外胚层)，⑶鳞状上皮细胞(外胚层)，(C)骨(中胚层)，⑶肠上皮以及(E)腺体(内胚层)。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖磊，鲍磊，何丽夏子，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：