本发明专利技术公开了一种鉴别广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法。该特征性核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。该核酸分子探针为GDF：5′-CTGTTGGCATCTTCTGAGTCTC-3′；GDR：5′-GGTGCGAGGTTGTGCTACTA-3′。其方法为是采用上述核酸分子探针GDF和GDR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定广东虫草，具体步骤按常规PCR方法进行。本发明专利技术以GDF和GDR作为引物，以广东虫草的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行PCR，扩增到特异性片段。经实验发现，仅广东虫草能够扩增到特异性片段，而其他虫草样品，如冬虫夏草，古尼虫草，蛹虫草，表生虫草，巴西虫草都没有扩增到任何片段，这表明本发明专利技术的核酸分子探针GDF和GDR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别广东虫草(子实体和菌丝体)及其相关制品的真伪。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的
，具体涉及用于鉴定广东虫草(Cordyc印S guangdongensis T. H. Li, Q. Y Lin & B. Song)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探针和鉴定广东虫草的方法。
技术介绍
冬虫夏草(虫草)是中国名贵中药材，具有保肺肾、补精益髓、化痰止咳的作用，常食可促进消化、调节免疫功能，增强人体抵抗力，市场需求日益增大。但随着人们的过度采集，使得野生虫草资源日益稀缺，几近濒危，价格大幅上升，形成恶性循环。冬虫夏草发酵菌丝体以及蛹虫草(菌丝体和子实体)的商业化生产缓解了虫草市场的压力，具有较好的市场潜力。广东虫草(Cordyc印s guangdongensis T. H. Li, Q. Y Lin & B. Song)是新发现的中国特有虫草新品种，于2006年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，保藏号为CCTCCNO. M206051，该虫草安全无毒可食，具有较好的抗氧化活性、抗疲劳和延寿作用。广东虫草的虫草素和腺苷含量虽比蛹虫草低、但比冬虫夏草高，其虫草酸含量与冬虫夏草比较接近，具有较好的开发应用价值。因此，快速且准确地鉴别广东虫草及其相关制品真伪的方法和技术是广东虫草商业化生产的重要技术，对广东虫草的商业生产与检验具有重要的意义。DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。利用分子生物学技术与手段对物种或个体的特征性序列进行分析研究，从而可以准确地对该特征性核苷酸序列进行探测则可快速和准确地对该物种或个体进行鉴别。目前，已有用于鉴别冬虫夏草、蜂头虫草等的核苷酸特征序列获得专利，但尚未见与广东虫草鉴定相关的核苷酸特征性序列的专利。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种利用分子生物学手段，从遗传本质上鉴别广东虫草及其相关制品真伪的特征性核苷酸序列。本专利技术的用于鉴别广东虫草的特征性核苷酸序列来源于广东虫草的核糖体rDNA 内转录间隔区ITSU ITS2和它们之间的5. 8S rDNA基因，具体序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种以鉴别广东虫草及其相关制品真伪的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)为基础设计的用于鉴别广东虫草的核酸分子探针，该核酸分子探针序列如下GDF 5~-CTGTTGGCATCTTCTGAGTCTC-3~ ；GDR 5~-GGTGCGAGGTTGTGCTACTA-3“。上述核酸分子探针序列⑶F和⑶R，它们的退火温度相近，均不能形成引物二聚体。该核酸分子探针具有极高的专一性，仅与广东虫草发生反应，而不与其他虫草或其他真菌反应。利用该探针通过PCR扩增可以快速的对广东虫草(菌丝体、子实体)及其相关制品进行鉴别。本专利技术的第三个目的是提供一种广东虫草快速鉴定试剂盒，包括上述核酸分子探针GDF和GDR，以及常规的DNA提取试剂和常规的PCR反应试剂。所述的广东虫草快速鉴定试剂盒优选包括虫草属真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物 ITSl 5~ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG"3~ 和 ITS4 -TCCTCCGCTTATTGATATGC_3~。该通用引物可以作为鉴定广东虫草的阳性对照。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴别广东虫草的方法，是采用上述核酸分子探针 GDF和GDR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定广东虫草，具体步骤按常规PCR方法进行。优选，利用ITSl和ITS4作为PCR引物，以广东虫草的基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照。本专利技术基于鉴别广东虫草及其相关制品真伪的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO. 1) 设计了特异性的核酸分子探针GDF和GDR，它们的退火温度相近，均不能形成引物二聚体， 以该核酸分子探针GDF和GDR作为引物，以广东虫草的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行PCR，获得的DNA片段，经测序其具体序列如SEQ ID NO. 2所示，其长度为32^p。并且经实验发现，利用本专利技术的核酸分子探针GDF和GDR进行扩增，仅广东虫草能够扩增到该特异性片段，而其他虫草样品，如冬虫夏草，古尼虫草，蛹虫草，表生虫草，巴西虫草都没有扩增到任何片段(如图幻，这表明本专利技术的核酸分子探针GDF和GDR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别广东虫草(子实体和菌丝体)及其相关制品的真伪。本专利技术采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅0. Ig就足够，方法简单，特异性好， 用时短，半日即可完成。附图说明图1是利用ITSl和ITS4作为引物按照常规的PCR方法对不同虫草样品进行PCR 的产物的电泳图，其中1、冬虫夏草，2、古尼虫草，3、蛹虫草，4、广东虫草，5、表生虫草，6、巴西虫草，M为2Kb的DNA分子量标准；图2是利用本专利技术的核酸分子探针GDF和GDR作为引物按照常规的PCR方法对不同虫草样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、冬虫夏草，2、古尼虫草，3、蛹虫草，4、广东虫草，5、表生虫草，6、巴西虫草，M为2Kb的DNA分子量标准。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1 广东虫草基因组DNA的提取和ITS rDNA基因的获得取0. Ig广东虫草样品置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，加入2% (w/v) CTAB抽提缓冲液600μ 1，其中含有2% (质量体积分数)的SDS，继续研磨几秒后倒入1. 5ml 微量离心管中，65°C水浴保温lh。冷却至室温后，向1. 5ml含有样品的微量离心管中加入等体积的饱和酚氯仿异戊醇(体积比为25 M 1)溶液，颠倒混勻2min，12000rpm离心15min，用200μ 1移液器将上清液转入新的离心管中，弃沉淀。上清液中加入与之等体积的氯仿异戊醇(体积比24 1)溶液，颠倒混勻2min, 12000rpm离心15min，用200 μ 1的微量移液器将含有DNA的上层(水相)小心地移入一只新管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提有机相1-2次，合并水相。将最终的上清液用200 μ 1的微量移液器小心转入一只新离心管中。往上清液(DNA溶液)中加入上清液的1/10体积的3mol/ L pH5. 2的乙酸钠，用手指轻弹离心管壁几次使之混勻。加入与DNA溶液(含盐溶液)等体积的异丙醇(_4°C预冷)轻轻混勻，于-4°C静置浊。12000rpm离心15min，弃上清液，用体积分数为75%乙醇水溶液洗涤沉淀物两次。室温下自然晾干。自然干燥后加入20μ1无菌的超纯水重悬，选用DNA纯化试剂盒(东盛生物科技有限公司的基因组纯化试剂盒，其货号为Ν1091)纯化重悬的DNA，而获得广东虫草的基因组DNA。取真菌ITS rDNA 通用弓丨物 ITSl -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3、和 ITS4 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3~，引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用HS-taqMix试剂盒(东盛生物科技有限公司的H本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于鉴别广东虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｇｕａｎｇｄｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｔ．Ｈ．Ｌｉ，Ｑ．Ｙ Ｌｉｎ ＆ Ｂ．Ｓｏｎｇ）的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李挺，宋斌，李泰辉，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81
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