本发明专利技术涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。其序列为Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu是全新的序列(D-Pyr是D型吡啶丙氨酸，D-Cys是D-型半胱氨酸，Bip是二苯基丙氨酸)，它们可以在1微摩尔水平上体外抑制基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶的活力，并在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂4及其应用，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶-9、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。
技术介绍
脓毒血症(s印sis) —直是一个严重的医学问题。早期脓毒血症不经过及时有效治疗可进展为重症脓毒血症和脓毒血症性休克，两者死亡率分别为20% 30%和40% 70%。医学界一直在研究有效的治疗手段，如早期对症治疗、激活蛋白C、皮质激素治疗等。 近年来随着医学研究的深入，对脓毒血症的认识和治疗取得了很大进展。其中，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在内毒素休克中扮演着重要角色。基质金属蛋白酶是一组由20几种结构相似和功能相关的蛋白内切酶组成。它们可以发挥正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器官发育等；这些酶还可以在诸如炎症，伤口愈合和肿瘤细胞转移中发挥病理作用。基质金属蛋白酶被更多的看作是这些病理过程的调节因子。在基质金属蛋白酶家族中有两种明胶酶，其中，明胶酶A/基质金属蛋白酶-2可在多数组织细胞中恒定表达，以维持组织细胞的基本功能；而明胶酶B/基质金属蛋白酶-9在TNF-α，IL-6等的细胞外因素的作用下大量诱导表达。表达出胞外的基质金属蛋白酶-9的酶活力又可以通过酶原的激活以及活性酶的抑制作用调节。中性粒细胞是循环系统中最丰富的白细胞，在机体受到细菌感染时，中性粒细胞可迅速作出反应，首先进入被感染部位，构成了机体免疫系统应对细菌感染的第一道防线。 中性粒细胞的细胞颗粒中储存有不同种预先产生的酶类，包括弹性蛋白酶(elastase)，基质金属蛋白酶-8(MMP-8)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。基质金属蛋白酶_8可切割胶原蛋白(collagen)，基质金属蛋白酶-9可继续把变性的胶原蛋白或明胶切割成更小的片段。基质金属蛋白酶-9本身也有切割VI型胶原蛋白的活力，VI型胶原蛋白是血管基底层的主要成分。与其它细胞不同，中性粒细胞不表达基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-I)。这使得中性粒细胞在受到诸如LPS，IL-8和PMA等的刺激时，迅速释放胞内颗粒，而释放的基质金属蛋白酶类可被同时释放的有氧自由基激活，在局部具有较高的浓度。这些酶除了具有正常的杀菌功能外，在病理条件下可能会对机体造成很大的破坏。内毒素模型就是一个很好的例子，在高剂量静脉注射LPS后(8mg/kg小鼠)，小鼠循环系统中的中性粒细胞可迅速释放胞内颗粒的内容物，血液中的基质金属蛋白酶-9的浓度在30分钟时就可以达到峰值，其酶活力可以发挥诸如破坏血管基底层等作用，并推进了休克症状的发展。这一点可由基质金属蛋白酶-9缺失(knockout)小鼠对内毒素休克的抑制作用证明。所以，基质金属蛋白酶-9可以作为以中性粒细胞为主的炎症反应的主要靶点。基质金属蛋白酶-9的抑制剂包括大分子和小分子。大分子抑制剂的制备和使用限制了它们的发展，例如重组人金属基质蛋白酶组织抑制因子-3的体内半衰期只有4分钟。很多成功的小分子抑制剂，例如Marimastat，可以在纳摩尔水平上抑制基质金属蛋白酶的活力，但小分子抑制剂缺乏特异性，如果在慢性疾病中长期使用缺乏特异性的基质金属蛋白酶抑制剂可产生副作用。因而，从基质金属蛋白酶酶抑制剂的应用角度来看，以急性炎症反应作为研究对象是正确的选择。在急性反应期，机体能够耐受短期的、金属介质蛋白酶-9广谱抑制剂对正常生理功能的抑制，同时使关键组织器官的生理结构免受破坏，增加了生存几率。通过化学方法合成了多肽抑制剂。这条多肽抑制剂可以选择性的抑制基质金属蛋白酶_8，基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶的活力，在用内毒素模型检测多肽抑制剂体内活力的实验中，多肽抑制剂能够使小鼠避过了注射LPS后血液中基质金属蛋白酶-9 的高峰期(30分钟血液浓度达到峰值)并抑制了肿瘤坏死因子(TNF-α)的释放(1小时时血液浓度达到峰值)，从而有效的保护了小鼠，度过了急性炎症反应期，增加了小鼠的生存率。目前，国际上开发出的基质金属蛋白酶抑制剂已进入II期临床(多发性硬化症， 类风湿性关节炎等)和三期临床(牙周炎等)。本专利中的五条多肽抑制剂已证明在急性炎症反应中有效，具有在其他炎症模型中开发的前景。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供全新的序列，该序列基质金属蛋白酶-9抑制剂，对急性炎症具有很好的疗效。技术方案 基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂4，其特征在于其序列为ftO- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bi p-Arg-Gly-Glujkq NO. 1。基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂4在制备治疗抑制急性炎症药物中的应用。有益效果利用固相合成法化学合成基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂4，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋白酶-9，_8，-3和肿瘤坏死因子释放酶的酶活力。在内毒素休克模型实验中成功的增加了小鼠的生存率。在急性炎症反应中，中性粒细胞释放大量酶和有氧离子，其中包括基质金属蛋白酶-8和基质金属蛋白酶_9，这些酶可以切割并破坏机体组织，造成损伤；单核巨噬细胞表达肿瘤坏死因子释放酶，这种酶可切割并释放肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子是炎症反应的核心细胞因子，有加重炎症反应的作用。我们发现的多肽抑制剂可以同时抑制基质金属蛋白酶-9，-8和肿瘤坏死因子释放酶的酶活力，从而减轻了炎症反应，保护机体并减轻炎症的破坏作用。附图说明附图1多肽化学法合成后用HPLC纯化的洗脱曲线。附图2基质金属蛋白酶-9切割荧光产生多肽的动力学曲线。附图3多肽抑制剂对基质金属蛋白酶-8的抑制曲线。附图4多肽抑制剂对基质金属蛋白酶-9的抑制曲线。附图5.多肽抑制剂对肿瘤坏死因子释放酶的抑制曲线。附图6.多肽抑制剂对基质金属蛋白酶-3的抑制曲线。附图7.多肽抑制剂对急性炎症反应的治疗作用。具体实施例方式实施例1多肽的化学合成方法多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质(可在Advanced ChemTech公司购得)上有自由氨基，顺序连接Glu, Gly, Arg, Bip, D-Cys, D-Pyr和Pro。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU， HOBt, DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑G 1 0. 的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应lOmin。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用 98%三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为ftO-(D-Pyr) -(D-Cys) -Bip-Arg-Gl y-Glu，该序列为全新序列。图1为多肽从介质上切割后用HPLC纯化的洗脱曲线。实施例2多肽抑制剂体外对几种靶点酶(基质金属蛋白酶_3，-8，-9及肿瘤坏死因子释放酶)的IC5O值。重组人基质金属蛋白酶-9由Sf9昆虫细胞表达.该酶用0.01 μ M的基质金属蛋白酶-3 活性位点活化,所用的缓冲液为 IOOmM Tris/HCl,pH 7. 4, IOOmM NaCl, IO本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．基质金属蛋白酶－９多肽抑制剂４，其特征在于其序列为Ｐｒｏ－（Ｄ－Ｐｙｒ）－（Ｄ－Ｃｙｓ）－Ｂｉｐ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ，其中Ｄ－Ｐｙｒ是Ｄ型吡啶丙氨酸，Ｄ－Ｃｙｓ是Ｄ－型半胱氨酸，Ｂｉｐ是二苯基丙氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡加亮，邱郑，李伟光，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84
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