本发明专利技术公开了一种利用微卫星技术鉴定草鱼的方法。本发明专利技术所述用于鉴定草鱼的微卫星引物序列如SEQIDNO:1~4所示。本发明专利技术从84对鲤科鱼类微卫星引物中筛选出2对用于鉴定草鱼的特异性微卫星标记，带型清晰，重复性好，可靠性强，可作为鉴定草鱼的特异性引物。本发明专利技术方法可以快速准确的将草鱼鉴别出来，不受环境条件和发育时期的影响，具有统计简便等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA分子标记检测领域，具体涉及。
技术介绍
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，又名鲩、草鲩、白鲩等，为我国主要淡水养殖鱼类之一，分布在全国各大水系。近年来因过度捕捞、大规模兴建水利工程、水质污染等影响，使草鱼资源量锐减，为了尽快掌握群体结构及其种质资源状况，从而制定和实施更科学合理的渔业管理政策，有必要对草鱼建立一种种的分子识别技术，微卫星标记则成为首选的标记之一，研究表明，在真核生物中大约每隔10-501Λ就存在1个微卫星，如在鱼类基因组中，微卫星被认为每隔101Λ左右就会出现一次(Wright，1993)，广泛分布于编码区、内含子以及非编码区中；微卫星DNA的侧翼序列较为保守，从而保证了 PCR扩增的高效性和稳定性，由于重复单元数目的变化，因此表现出长度多态性(即SSR)，该标记方法尤其表现在对 DNA样品的要求不高，即使样品DNA有一定程度的降解，利用微卫星分析也能得到较好的结果，非常有利于分析特殊样品(如化石样品、乙醇固定的鱼苗等)，由于其具有上述优点，SSR 被广泛应用于遗传图谱的构建、QTL、品种鉴定等领域。目前，对草鱼的鉴别方法主要有3种(1)形态法通过对草鱼的外部形态特征进行鉴定，如体型、肌节数等，该法简便、经济、直观，对成体草鱼都能得到较好的鉴定结果，但是并不能将其应用于仔稚鱼的鉴定研究，因为早期发育的仔稚鱼经乙醇固定后会脱水、变形、某些色素会有所消失，而且会带一定的主观色彩，严重制约了形态鉴定的可行性.(2) 同工酶法主要是通过聚丙烯酰胺凝胶或淀粉凝胶电泳进行，如李思发(1990)对长江四大家鱼原种的10种同工酶电泳分析表明，其同工酶谱可作为四大家鱼种质鉴定标准，但同工酶表达与组织发育时期有关，限制了其在仔稚鱼鉴定中的应用，(3)分子标记法在分子标记方面，RAPD常用于物种鉴定中，如薛国雄等对长江、珠江、黑龙江3大水系的草鱼的RAPD 分析表明，每一水系的草鱼特征性基因图谱可作为种群鉴定的依据，但RAPD标记重复性和稳定性较差，鉴于此，微卫星标记则为最佳的分子标记之一，目前，也有好多学者将其应用于品种鉴定领域，如公开号为CN1370834A的专利申请“适于猪品种分类的微卫星DNA标记”以及扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用等，关于草鱼也有许多微卫星标记的研究，但其目的用于分析草鱼的遗传多样性而不是用于物种鉴定，所以，利用微卫星引物资源共享，设计和探究一种微卫星技术鉴定草鱼的方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种准确的鉴定草鱼的微卫星标记方法，可用于草鱼早期资源鉴定。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现本专利技术参考已发表的文献中的79对鲤科鱼类微卫星引物，从中筛选出一组(2对引物)能鉴定草鱼的特异性微卫星引物。通过二种微卫星的识别，可将其它观种鱼类与草鱼区别 (见附录)。本专利技术的草鱼微卫星DNA标记主要用于鱼类早期资源鉴定中区分草鱼、早期资源鱼类群落结构分析、江河生态评价等，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。本专利技术的具体步骤如下1)传统的酚-氯仿法提取草鱼及其它鱼类基因组DNA(表1)；2)引物设计与优化，从NCBIdbEST中搜索草鱼的ESTs序列，用软件SSRHutterl. 3进行SSR的查找，然后用I^rimer Premier5. 0进行引物设计，获得草鱼EST-SSR引物84对，并对这些引物使用温度梯度PCR仪进行退火温度的优化；3)PCR扩增用上述引物以草鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR反应体系为20ul 0. 5umol/L 的引物，0. 2 mmol/L 的 dNTP，2 mmol/L 的Mg2+，1 XPCR 反应缓冲液，IU 的 iTaq DNA 聚合酶；用这些引物时设置的PCR程序参数为94°C预变性:3min，30个循环94°C变性30s， Ta下退火30s，72°C延伸45s，最后72°C延伸7min ；4)PCR产物检测PCR扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，然后用0. 1% 的AgNO3染色lmin，银染后用的Na0H、0. 2%无水Na2C03、0. 4%甲醛显色2min，直至条带清晰为止；5)草鱼单态性引物的筛选，在84对微卫星引物中共筛选到草鱼单态性引物59对，占到所用引物的70%。6)草鱼特异性引物的筛选，用步骤5获得的59对单态性引物分别对草鱼和其它观种鱼类按上述条件进行PCR扩增、电泳，用以筛选草鱼的特异性微卫星位点，结果显示这些引物在这些鱼类中要么扩增出与草鱼大小相同或相近的片段，要么扩增不出任何产物， 最后选择在这观种鱼类中均无任何扩增产物的2个微卫星位点作为草鱼的鉴定用位点，最终将草鱼与其他鱼类相分开。获得的引物序列如SEQ ID Ν0:Γ4所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术从84对微卫星引物中筛选出2对用于鉴定草鱼的特异性微卫星标记，带型清晰、重复性好、可靠性强，可作为草鱼的特征性引物。鉴于草鱼在种苗发育阶段不易通过形态特征进行识别，通过本专利技术的应用，可以将其快速、准确地鉴别出来，同时，本专利技术具有不受环境条件及发育时期的影响，统计简便等优点。附图说明图1为引物C3210在草鱼不同群体个体内的扩增图谱(1-10为桂平样品，11-20为河源样品，21-30为西牛样品)；图2为引物C41^6在草鱼不同群体个体内的扩增图谱(1-10为桂平样品，11-20为河源样品，21-30为西牛样品)；图3为引物Q3210在其他观种鱼类基因组DNA中的扩增图谱(序号相对应的种类见附录)。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例(1)提取草鱼及其它鱼类基因组DNA:剪取经乙醇固定的鱼类鳍条约20mg，用滤纸吸干表面的无水乙醇，加入500ml STE裂解液(IOOmM NaCL; ImM EDTA (PH=8. 0) ； 10 mM Tris-CL (PH=8. 0)),剪碎，再加入 60ml SDS(10%),以及IOul的蛋白酶K(20mg/ml)，56°C水浴直至溶液澄清为止；加入等体积酚 氯仿异戊醇(25: : 1)抽提两次；12000r离心lOmin，取上清；加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提一次，12000r离心lOmin，取上清；加入等体积冰冷的无水乙醇，12000r离心IOmin,弃上清；加入600ml 70%的乙醇洗涤沉淀，8000r离心IOmin,倒掉乙醇，待乙醇挥发干净时加入80ul无菌蒸馏水，4°C保存直至DNA完全溶解，然后用紫外分光光度计测其 OD值并稀释至40ng/ml备用。(2)引物设计与优化选取重复次数在5次以上的双碱基重复序列和重复次数在4次以上的三碱基或四碱基重复序列，使用引物设计软件I^imer Premier5. O进行引物设计，获得EST-SSR引物84对， 然后以不同群体中个别草鱼的基因组DNA混合物为模板，进行引物的优化，起始所有引物均以Tm值为50°C进行扩增，然后根据扩增结果进行适当的增减，范围为45°C _65°C。(3) PCR 扩增用上述优化的引物对草鱼不同群体内个体的基因组DNA进本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用微卫星技术鉴定草鱼的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：（１）提取鱼类ＤＮＡ（包括草鱼及其它２８种鱼类鳍条基因组ＤＮＡ），测定其ＯＤ值，于－２０℃储存备用；搜索ＮＣＢＩ ｄｂＥＳＴ中草鱼的ＥＳＴｓ序列，用软件ＳＳＲＨｕｔｔｅｒ１．３进行ＳＳＲ的查找，然后用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０进行引物设计并对其进行优化，在２９种鱼类ＤＮＡ样本中进行筛选，筛选到识别草鱼的２对特异性微卫星引物；用这些引物在９６个不同来源的草鱼ＤＮＡ样本中进行验证，微卫星带谱稳定；（２）分别将所提的草鱼及其它鱼类基因组ＤＮＡ稀释为４０ｎｇ／ｍｌ；（３）优化引物的退火温度，并用这些引物对草鱼不同群体内个体的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系为２０ｕｌ：０．５ｕｍｏｌ／Ｌ的引物，０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇ２＋，１×ＰＣＲ反应缓冲液，１Ｕ的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶；使用这些引物时设置的ＰＣＲ程序参数为：９４℃预变性３ｍｉｎ，３０个循环：９４℃变性３０ｓ，Ｔａ下退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，最后７２℃延伸７ｍｉｎ；（４）ＰＣＲ扩增产物经１０％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，２２０Ｖ稳压电泳３小时，然后用０．１％的ＡｇＮＯ３染色１ｍｉｎ， 银染后用２％的ＮａＯＨ、０．２％无水Ｎａ２ＣＯ３、０．４％甲醛显色２ｍｉｎ，直至条带清晰为止，并拍照保存；（５）在８４对微卫星引物中筛选到草鱼单态性引物５９对，占到所用引物的７０％；（６）用上述单态性引物分别对草鱼和其它２８种鱼类按上述条件进行ＰＣＲ扩增、电泳，筛选出在这些鱼类中没有任何扩增产物的引物，最终将草鱼与其他鱼类相分开；所述２对特异性引物序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４所示。...
【技术特征摘要】
1. 一种利用微卫星技术鉴定草鱼的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)提取鱼类DNA(包括草鱼及其它28种鱼类鳍条基因组DNA)，测定其OD值，于_20°C 储存备用；搜索NCBI dbEST中草鱼的ESTs序列，用软件SSRHutterl. 3进行SSR的查找， 然后用I^rimer Premier5. 0进行引物设计并对其进行优化，在四种鱼类DNA样本中进行筛选，筛选到识别草鱼的2对特异性微卫星引物；用这些引物在96个不同来源的草鱼DNA样本中进行验证，微卫星带谱稳定；(2)分别将所提的草鱼及其它鱼类基因组DNA稀释为40ng/ml；(3)优化引物的退火温度，并用这些引物对草鱼不同群体内个体的基因组DNA进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 20ul :0. 5umol/L 的引物，0. 2 mmol/L 的 dNTP，2 mmo...
【专利技术属性】
技术研发人员：李新辉，杨计平，李捷，谭细畅，王超，李跃飞，赖子尼，吴瑞全，吴茜，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：81
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