本发明专利技术涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；(2)提取血液样品中基因组DNA；(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经变性或酶切后分别得到变性样品溶液、酶切样品溶液；(5)样品检测：分别在变性样品溶液和酶切样品溶液中加入10×SYBR?Green?I荧光染料与基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充聚环氧乙烷筛分介质，分别进行CE-SSCP或CE-RFLP检测即可。本发明专利技术操作简单、重现性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析方法应用研究领域中的毛细管电泳检测方法，尤其涉及。
技术介绍
基因突变的检测在临床疾病诊断中起着十分重要的作用。目前，筛查基因点突变常常采用以PCR为基础的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳与各种基因突变检测技术相结合的方法，这些方法在满足临床快速检测基因突变的需要时有一定的局限性。因此建立一种准确快速地用于临床诊断的基因突变检测方法势在必行。毛细管电泳(CE)是一种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点，广泛应用于分子生物学、分子医学和生命科学等方面。CE与各种基因突变检测技术例如SSCP(单链构象多态性检测)、RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)相结合时，在突变基因检测方面显示了无可比拟的优越性。在 1984 2010年中国专利数据库中记载了申请号为200510026931. X的中国专利《一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法及试剂系统》、专利号为200910042599. 4的中国专利《用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用》、申请号为200810005523. X的中国专利《检测基因突变的方法》、申请号为201010134207. X的中国专利《APC基因突变的快速检测》申请号为200910201917. 7的中国专利《一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用》，上述专利仅仅公开了采用实时定量荧光PCR、测序、高分辨率溶解曲线法、荧光双环探针技术等基因突变检测方法对组织中或血液中肿瘤基因突变进行了检测，而采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP用于检测血液中肿瘤突变基因的方法及应用却未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、重现性好的用于检测血液中肿瘤突变基因的方法。为解决上述问题，本专利技术所述的，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中， 使最终溶液浓度为2. 5 3. 5%、pH值为7. 5 9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um或0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育2 他；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA ；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA ；所述Tris缓冲液I与所述血液样品的体积比为1 2 3;所述Tris缓冲液II与所述血液样品的体积比为1 0.5 1;所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1 0.03 0.05;所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1 1 1.5;所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为 1 1. 5 2. 0 ；(3)需检测基因目的片段扩增将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计 P53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理将p53基因PCR扩增样品和k_ras基因PCR扩增样品经94 97°C 变性8 IOmin后，冰浴5 lOmin，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 8h,在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k_ras 基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1. 5 1. 8 0. 2 0. 3 ； 所述P53基因PCR扩增样品与所述Msp I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；所述k_ras基因PCR扩增样品与所述BstN I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；(5)样品检测①在17 22ul变性DNA样品溶液中分别加入10 X STOR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；②在17 22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10 X STOR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。所述步骤(1)中的IXTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。所述步骤O)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。所述步骤⑵中的Tris缓冲液I是指由pH值为8. O且lOmmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。所述步骤(2)中的Tris缓冲液II是指由pH值为8. 0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDQ混合而成的缓冲液。所述步骤O)中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。所述步骤(3)中的扩增条件为94°C变性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s， 共行30个循环。所述步骤(4)中的Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐 (Tris-acetate)、IOmM 醋酸镁(Mg-acetate)、66mM 醋酸钾(K-acetate)、0. lmg/ml N，0_ 双三甲硅基乙酰胺(BSA)混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)的pH值为7.9，温度为37°〇。所述步骤(5)中10 X STOR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为 1 3 1 4。本专利技术与现有技术相比具有以下优点1、本专利技术采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP突变检测技术，与传统平板电泳检测基因突变相比较，具有良好的温度控制系统，能有效控制温度在15 20°C，从而保证了检测结果的准确性和重现新。2、本专利技术以含有IXTBE缓冲液的聚环氧乙烷(PEO)作为筛分介质，具有良好分离效能，可完成对血液样品中肿瘤突变基因的检测(参见图2、图3、图4、图本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：（１）含ＴＢＥ的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入１×ＴＢＥ缓冲液中，使最终溶液浓度为２．５～３．５％、ｐＨ值为７．５～９．０后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用０．２２ｕｍ或０．４５ｕｍ水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；（２）血液样品中基因组ＤＮＡ提取：在血液样品中加入Ｔｒｉｓ缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Ｔｒｉｓ缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶Ｋ，５５～５７℃水浴孵育２～６ｈ；孵育结束后加入酚－氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀ＤＮＡ；该沉淀ＤＮＡ经室温自然干燥至恒重时，即得基因组ＤＮＡ；所述Ｔｒｉｓ缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为１∶２～３；所述Ｔｒｉｓ缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为１∶０．５～１；所述蛋白酶Ｋ与所述血液样品的体积比为１∶０．０３～０．０５；所述酚－氯仿与所述血液样品的体积比为１∶１～１．５；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为１∶１．５～２．０；（３）需检测基因目的片段扩增：将所述基因组ＤＮＡ作为扩增模板，采用ｐｐ５设计ｐ５３基因及ｋ－ｒａｓ基因目的片段扩增引物，进行常规ＰＣＲ扩增，即得ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品和ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品；（４）样品处理：将ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品和ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品经９４～９７℃变性８～１０ｍｉｎ后，冰浴５～１０ｍｉｎ，得到变性ＤＮＡ样品溶液；或分别在ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品、在ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品中加入三蒸水、Ｔａｎｇｏ缓冲液，并在ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品中加入ＭｓｐⅠ内切酶、在ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品中加入ＢｓｔＮⅠ内切酶，在３７℃孵育４～８ｈ，在８０℃灭活１５～２０ｍｉｎ后，得到酶切ＤＮＡ样品溶液；所述ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品、ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品分别与三蒸水、Ｔａｎｇｏ缓冲液的体积比为１∶１．５～１．８∶０．２～０．３；所述ｐ５３基因ＰＣＲ扩增样品与所述ＭｓｐⅠ内切酶的体积比为１∶０．１～０．２；所述ｋ－ｒａｓ基因ＰＣＲ扩增样品与所述ＢｓｔＮⅠ内切酶的体积比为１∶０．１～０．２；（５）样品检测：①在１７～２２ｕｌ变性ＤＮＡ样品溶液中分别加入１０×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光染料、所述步骤（２）所得的基因组ＤＮＡ，混匀后加入去离子水至体系为３０～５０μｌ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为１０～２０ｋｖ、温度为１５～２０℃的条件下采用负极－１０ｋｖ电动进样的方式进行ＣＥ－ＳＳＣＰ检测即可；②在１７～２２ｕｌ酶切ＤＮＡ样品溶液中分别加入１０×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光染料、所述步骤（２）所得的基因组ＤＮＡ，混匀后加入去离子水至体系为３０～５０μ１；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为１０～２０ｋｖ、温度为１５～２０℃的条件下采用负极－１０ｋｖ电动进样的方式进行ＣＥ－ＲＦＬＰ检测即可。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣，贾正平，谢华，谢希辉，
申请(专利权)人：王荣，
类型：发明
国别省市：62
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