本发明专利技术公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒对华法林用药相关的四个SNP位点进行分型，包括：VKORC1基因上的rs9934438?SNP位点、CYP2C9基因上的rs1799853和rs1057910?SNP位点及CYP4F2基因上的rs2108622?SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述四个SNP位点的分型，从而达到对华法林合理用药提供分子生物学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法，尤其是利用多重PCR 结合分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
技术介绍
华法林是一种双香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子II、VII、IX、X，从而发挥抗凝作用。在临床上主要用于防治血栓栓塞性疾病，如治疗血栓栓塞性静脉炎，降低肺栓塞的发病率和死亡率，减少外科大手术，如髋关节固定术、人工置换心脏瓣膜手术等的静脉血栓发生率，以及作为心肌梗塞的辅助用药。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、种族、体重、 饮食等临床因素影响外，华法林的靶酶VKORCl和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而当前确定华法林需求剂量是无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。含有Y-谷氨酸残基的维生素K依赖性凝血因子II、VII、IX、X，以及蛋白C和S， 必须经过维生素K依赖性羧化酶(Y-谷氨酸基羧化酶)的羧化作用才能成为有活性的凝血因子。在羧化成过程中，耦联氢醌型维生素K被氧化成环氧型维生素K。香豆素类抗凝药 (华法林)作为维生素K拮抗剂通过阻断维生素K还原，使得含有谷氨酸残基的凝血因子 II、VII、IX、X，以及蛋白C和蛋白S停留在没有抗凝血生物活性的前体阶段。这类蛋白与氧化失活的维生素K结合，进一步阻碍维生素K环氧化物由环氧型向氢醌型转变。体内环氧型维生素K被还原为氢醌型维生素K由维生素K环氧化物还原酶复合体(VKORC)完成， 药理学研究表明，VKORC是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，VKORC由VKORCl激活， VKORCl不但主导维生素K依赖性凝血因子的生成，而且是香豆素类抗凝药物-华法林的作用靶点。中国台湾学者Yuan HY报道，华法林维持剂量与VKORCl启动子区域多态性有关。 VK0RC1-1639位G/A(rs9934438)变异导致其启动子活性不同。VK0RC1GG和AG基因型与 AA基因型相比，GG和AG基因型由于其启动子活性高，VKORClmRNA表达增加，VKORCl蛋白也相应增加，引起VKORC活性增高，从而凝血因子生成较多，由于VKORCl蛋白是华法林作用靶点，所有华法林敏感者1.5mg)全是基因型为AA的纯合子，而华法林抵抗的个体其基因型为AG或GG。Geiser等研究表明，VK0RC1-1639G/A基因多态性存在民族差异， VK0RC1-1639G/A基因多态性是民族之间华法林剂量差异的主要原因。华法林在体内的代谢主要通过肝脏细胞色素氧化酶P450 (CYP)系，华法林含S型和R型2种异构体，S型主要经肝脏CYP2C9代谢，R型由CYP3A4代谢，其中S型华法林的抗凝活性比R型强3 5倍，因此CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。国外文献报道 86%的CYP2C9突变病例仅需要很低的维持剂量((1. 5mg. cf1)，而需要低维持剂量的普通患者为38%，以此具有CYP2C9突变等位基因的个体需要减量给药以较少不良反应的发生。 在我国汉族人群中，该基因的突变型以CYP2C9*3为主，但频率较低，野生纯合型为92. 7%, CYP2C9*2/CYP2C9*3型为6. 6%、CYP2C9*3纯合型为0. 7%。两种突变型都与华法林代谢酶的损伤有关，从而导致个体在抗凝治疗中所需的华法林剂量较正常人低。CYP2C9*3纯合子以及CYP2C肿2和*3的突变型杂合子(CYP2C肿2/ )者华法林需要剂量比野生型纯合子低 60% 75% ；与野生型比较，CYP2C9*2、CYP2C9*3突变型者的需要剂量明显降低，达到稳态时间延长。在同等剂量时INR值偏高，发生危及生命的严重出血事件的风险增大。因此，用药前进行CYP2C9基因型检测，有助于预测患者的最佳华法林负荷剂量，降低出血事件的发生率。CYP4F2是代谢花生四烯酸产生二十四烯酸最主要的代谢酶，近来发现CYP4F2基因的一个V433M突变使花生四烯酸代谢能力下降，二十四烯酸的产生减少，即此突变降低了 CYP4F2的酶活性。CYP4F2为维生素K的单氧酶，可氧化底物生成ω -羟基衍生物，而且不同基因型的人肝脏微粒显示出不同的维生素K代谢活性，野生型CC基因肝微粒代谢活性最高，而突变纯合型TT基因肝微粒体代谢活性最低，为CC基因型的75%从而减少维生素K 的代谢，使维生素K的浓度升高，进而影响华法林的作用。为了达到相同的抗凝效果，CYP4F2 V433M(rs2108622)位点突变型TT患者需要提高华法林剂量。
技术实现思路
华法林的靶酶VKORCl和代谢酶CYP2C9、CYP4F2的基因遗传多态性直接或间接影响华法林在体内的抗凝效果和代谢过程。本专利技术提供一种利用多重PCR结合分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。本专利技术采用的技术方案一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒可同时对VKORCl基因rs9934438 SNP位点、CYP2C9基因rsl799853 和rsl057910 SNP位点及CYP4F2基因rs2108622 SNP位点进行扩增分型检测，以ALB基因为内参来检测扩增条件；野生型2 X缓冲包含上述4个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2 X缓冲液包含上述4个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。所属检测VKORCl基因rs9934438 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT正向突变型引物CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC反向共用引物GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC所属检测CYP2C9基因rsl799853 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC正向突变型引物GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT反向共用引物ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT所属检测CYP2C9基因rsl057910 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT正向突变型弓丨物AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG反向共用引物ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA所属检测CYP4F2基因rs2108622位点的两个正向引物以及一个反向本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测华法林个体化用药相关ＳＮＰ位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因ＶＫＯＲＣ１ ｒｓ９９３４４３８ ＳＮＰ位点的引物、检测基因ＣＹＰ２Ｃ９ ｒｓ１７９９８５３和ｒｓ１０５７９１０ ＳＮＰ位点的引物及检测基因ＣＹＰ４Ｆ２ｒｓ２１０８６２２ ＳＮＰ位点的引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊领，杜宏伟，周毓玲，崔丽娟，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，天津滨海协和基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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