本发明专利技术公开了一种检测7处与华法林用药剂量相关的基因多态位点的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对与华法林用药剂量相关的7处基因多态位点进行检测。使用该产品，对华法林服用者在7处基因多态位点的基因型进行检测，检测结果结合其他临床指标，可为临床医师合理制定华法林剂量提供参考，避免药物不良反应。本发明专利技术能在一个反应体系内对不同基因上的7处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及ー种用于确定华法林用药剂量相关的基因多态位点(SNP)的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技木，对华法林用药剂量相关的7个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。
技术介绍
华法林是目前应用最广泛的一类双香豆素衍生物类ロ服抗凝药，临床上主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，在心脏瓣膜置換、支架放置等外科手术后也需要服用华法林来减少静脉血栓发生率。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，达到相同作用效果，高低剂量者可相差10倍以上。剂量过大易导致出血并发症，严 重者将危及生命，剂量不足则难以达到预期抗凝疗效，容易造成血栓，严重者亦危及生命。临床上常以凝血酶原时间(PT)及国际标准化比值(INR)作为监测指标，以达到安全有效地使用它。因此临床医生常先根据患者的ー些临床指标，如身高、体重、年龄、性别等，给予ー定经验剂量，然后根据每个患者INR值的情况，反复调整剂量并监测，直至INR达到合理范围，从而确定需要的维持剂量，长时间的进行维持治疗。造成华法林用量个体差异的原因很多，可分为非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要有年龄、身高、体重，药物的相互作用，饮食习惯，疾病状态等。近年的研究表明，遗传因素在华法林用量个体差异的表现中起到一定的作用。影响华法林用量个体差异的遗传因素是指与华法林的药动学和药效学有关的蛋白或酶的基因发生变异，影响蛋白的表达或酶的活性，从而增强或降低华法林的疗效，使不同个体间的用量产生差异，这些遗传因素包括VKORCl、CYP2C9、CYP4F2、GGCX, CALU等基因上的基因多态位点。华法林主要通过作用于VKORCl基因编码的蛋白，抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子，从而发挥抗凝作用。多个报道表明，VKORCl基因-1639位的G/A基因多态位点(rs9923231)可导致基因启动子活性差异，与AA基因型相比，GG和AG基因型启动子活性高，凝血因子生成较多，患者临床表现出华法林抵抗。维生素K依赖性凝血因子，含有Y -谷氨酸残基，必须经过GGCX基因编码的维生素K依赖性羧化酶的羧化作用后，才能成为有活性的凝血因子，进而引起凝血反应。有研究表明，GGCX编码基因上rsll676382基因多态位点将引起酶活性变化，进而改变有活性凝血因子的有效浓度，影响患者所需华法林剂量的变化。CALU基因编码的钙腔蛋白具有调节VKORCl基因产物的功能，有报道表明，该基因上rs339097位点若为G基因型，患者需要更多的华法林剂量。华法林在体内的代谢主要是通过肝脏细胞色素氧化酶P450 (CYP)系统。其中，CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。人CYP2C9基因具有遗传多态性，其中最常见的为 CYP2C9*2 (rsl799853)、CYP2C9*3 (rsl057910)、CYP2C9*6 (rs9332131)等基因多态位点，这些位点突变后，基因编码酶的活性较野生型大幅降低，导致患者对华法林的代谢及清除能力大幅降低，临床表现出对华法林敏感，需要減量给药以減少不良反应的发生。CYP4F2为维生素K的单氧酶，近来发现CYP4F2基因V433M (rs2108622)位点TT型患者需要提高华法林剂量，方能达到相同的抗凝效果。综上所述，基因多态位点是导致华法林需求剂量存在个体差异的因素之一，用药前进行相关的基因多态性检測，结合临床因素，有助于为患者作出合理的华法林剂量，缩短调整时间，降低严重不良反应的发生率。目前用于指导华法林用药剂量的基因多态位点检测产品较少，而且检测靶点集中于 VK0RCl(rs9923231)和 CYP2C9*2 (rsl799853)、CYP2C9*3(rsl057910)等少数几个基因多态位点，对其他位点涉及较少。而且目前常用的检测技术中，测序和实时荧光定量PCR均需对多个位点逐一进行检测，操作复杂，费用较高。例如，中国专利申请200710135388. 6、“华法林中国人群个体用药剂量的确定方法”公开了ー种利用限制性酶切法确定VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9的基因型的方法。由于该方法操作慢，准确性低，临床易污染，不能多重检测，因此不能解决以上技术问题。中国专利申请201010234597. 8、“一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法”，涉及PCR联合电泳检测方法，只能针对2个SNP位点进行检测，不能进行多重检测，且其准确性低，临床易污染，因此也不能解决以上技术问题。中国专利申请201110211124. 0、“检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法”，公开了ー种PCR联合电泳法可检测4个SNP位点的方法，该方法相对于以往技术有了一定进步，但仍然存在检测SNP位点的数量不多，且电泳显示结果存在的固有准确性低，临床易污染的缺陷，因此也不能解决以上技术问题。中国专利申请200910053954. 8、“华法林抗凝血药物疗效检测”公开了ー种检测个体华法林抗凝血药物疗效的试剂盒，其涉及荧光定量PCR，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。由于该方法仅涉及两个SNP位点，且荧光定量PCR检测存在合成探针成本高、过程复制且时间过长，因此尽管不同于以上技术，也不能解决以上技术问题。中国专利申请201110328422. 8、“ ー种用于检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的试剂盒”公开了ー种进行华法林用药相关基因多态性检测的试剂盒，其涉及DNA测序技木，尽管检测区域内每个位点都能被检测到，并可能指导临床用药，但测序技术的缺点在于灵敏度低，不能多重检测，操作慢。因此，也不能解决以上技术问题。综合所述，目前存在的技术问题是缺乏一次能同时检测多个与华法林用药剂量相关的基因多态位点的方法和产品，常见的检测技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高，因此，目前已有的检测方案，大多数仅针对 VKORCl (rs9923231)、CYP2C9*2 (rsl799853)和 CYP2C9*3 (rsl057910)等少数几个多态位点。因此目前需要ー种不同于以往的检测技术，能检测尽量多SNP位点、且能在同一体系中针对同一个体的多个SNP或者针对多个个体中的ー个或多个不同的SNP的技术，通过该技术的检测信息，为确定华法林剂量提供參考依据
技术实现思路
本专利技术原理在于提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测华法林用药剂量相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中在多重PCR中同时扩增多达7个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在7个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。因此，本专利技术第一个目的是本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测7处与华法林用药剂量相关的基因多态位点的引物系统，其序列为编号序列针对位点用途2.权利要求I的引物系统，其中PCR引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护5-15个碱基序列，优选为IObp的tag :ACGTTGGATG。3.权利要求I的引物系统，其中延伸引物5’端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。4.由权利要求I至3的引物系统所制备的用于检测华法林用药剂量相关基因多态位点的检测产品。5.权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括 (1)用于PCR的反应试剂，包括特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs,PCR反应缓冲液； (2)用于PCR产物纯化的试剂； (3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括阴性质控品，阳性质控品，纯化用树月旨，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。7.权利要求5的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ΕχοΙ，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。8.权利要求7的产品，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。9.使用权利要求1-3的引物，或权利要求4-8的产品来检测华法林用药剂量相关基因多态位点的方法，包括 (1)多重PCR:...
【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，赵洪斌，张海燕，李京励，
申请(专利权)人：向华，
类型：发明
国别省市：
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