本发明专利技术提供了一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括10×PCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，其中，引物包括检测ompT基因的引物、检测chuA基因的引物、检测yjaA基因的引物和检测TSPE4.C2基因的引物。本发明专利技术在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4.C2基础上引入E.coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，四对引物联合使用，能够对待测样品是否为大肠埃希氏菌以及属于A、B1、B2、D哪个种系发育群进行快速鉴定，特异性高，可检测出样品中的痕量DNA，能够用于食品以及疾病诊断治疗应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别是一种大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒及其检测方法，特别是一种鉴定大肠埃希氏菌及其种系发育群的多重PCR试剂盒及其检测方法。
技术介绍
大肠埃希菌(Escherichia, coli, E. coli)属是肠杆菌科中一大群生物学特性极其相似的革兰氏阴性菌，在自然界中广为分布，是人和动物的共生菌之一，但有些菌株常可引起人和动物感染，近年来E. coli感染已位居临床感染病例第一位。此外，E. coli也是食品污染的主要细菌。E. coli种类繁多，菌体表面结构复杂，且致病菌与非致病菌之间不易区别，采用传统的生物学鉴定方法不但复杂、准确性差，而且费时；采用血清学方法鉴定，不但血清型种类繁多，鉴定时必须有标准血清，而且血清型与致病性没有必然联系。近年来对E. coli进行种系发育进化研究分析将大肠埃希氏菌划归到四个种系发育群(八31，82和0)， 肠外感染的强毒株主要属于B2群,肠出血性菌株属于D群,大多数共生菌株属于A群,动物感染菌株主要属于B1群。但由于肠杆菌科至少有12个属，E. coli与其他11个属之间的生物学特性也极为相近，难以区别，至今尚缺少快速、简便、特异的鉴定方法。因此，建立一种准确、简单、快捷、既能区别E. coli与不同属成员，又能区别E. coli不同种系发育群(即致病性还是机会致病性或共生性大肠埃希氏菌)的检测鉴定方法，是E. coli鉴定和疾病诊断实践中急需解决的问题。Clermont O等采用chuA, yjaA和TSPE4. C2三个基因片段对大肠埃希氏菌种系发育群进行鉴定(Rapid and simple determination of the Escherichiacoli phylogenetic group.,Clermont 0,Bonacorsi S,Bingen E.,Appl EnvironMicrobiol. 2000 Oct; 66 (10) : 4555-4558.)。因为 chuA 存在于 B2 群和 D 群，而在 A 群和 B1群中不存在；同时，7」&八在B2群中为阳性，而在D群中为阴性，因此可将B2群和D群区别开来；TSPE4. C2存在于B1群中，但不存在于A群中，因此可用于区分B1群和A群。同时，由于大肠埃希氏菌均带有ompT基因，且通过对四群12株大肠埃希氏菌的ompT全基因克隆测序结果分析得到该基因具有高度保守性，同源率超过98%以上，因此，该基因可用于区分大肠埃希氏菌与其他菌的标志性基因。本专利技术正是基于以上原理，建立一种能够快速、准确的鉴定是否有大肠埃希氏菌以及属于哪个种系发育群的PCR试剂盒以及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒，在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4. C2基础上引入E. coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，解决目前尚无一种既能快速区别E. coli与不同属成员，又能区别E. coli中不同种系发育群的检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供利用大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒的检测方法。本专利技术通过以下技术方案来实现一、一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括10XPCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，所述的引物为(I)检测ompT基因的引物上游引物序列5'-GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3' (SEQ ID No. I)上游引物序列5'-GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID No. 2)(2)检测chuA基因的引物上游引物序列5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' (SEQ ID No. 3)上游引物序列5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' (SEQ ID No. 4)(3)检测yjaA基因的引物上游引物序列5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' (SEQ ID No. 5)上游引物序列5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (SEQ ID No. 6)(4)检测TSPE4.C2基因的引物上游引物序列5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' (SEQ ID No. 7)上游引物序列5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' (SEQ ID No. 8)。所述的各个组分的终浓度是每对引物的浓度分别为I. O μ mol/L, DNA聚合酶浓度为 O. 25U/ μ L, dNTP 浓度为 2mmol/L。二、一种使用上述的大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒的检测方法，该方法包括以下步骤( I)取待测样品，构建PCR反应体系(2) PCR 扩增，条件为:预变性 94°C 5min ;然后以 94。。40s、50°C 30s,72°C 40s 进行30个循环；最后72 °C 7min结束；( 3 )将扩增产物进行电泳检测；(4)根据ompT基因、chuA基因、yjaA基因、TSPE4. C2基因目标片段的有无，对是否是大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌种系发育群进行鉴定。采用上述技术方案的积极效果本专利技术在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4. C2基础上引入E. coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，四对引物联合使用，能够对待测样品是否为大肠埃希氏菌以及属于A、B1, B2, D哪个种系发育群进行快速鉴定，特异性高，并对多重PCR反应体系和条件进行了优化；该试剂盒的最低灵敏度为103CFU/mL，可检测出样品中的痕量DNA ;使用范围广，能够用于食品以及疾病诊断治疗应用。 附图说明图I是本专利技术的原理示意图；图2是本专利技术的试剂盒检测结构图；图中M:DNA Marke，1_4分别为A :大肠埃希氏菌C83919、B1 :大肠埃希氏菌2002-1、B2 :大肠埃希氏菌J96、D :大肠埃希氏菌0157H:7EDL933。图3是本专利技术的试剂盒特异性实验检测结果图；图中1 :弗氏志贺菌ATCC 12022，2 :肺炎克雷伯菌ATCC 35281，3 :普通变形杆菌ATCC 49027，4 :绿脓杆菌 ATCC 27853，5 :牛巴氏杆菌 CVCC 44702，6 :鸡沙门氏菌 CVCC520，7:奇异变形杆菌CVCC 1969，8 :无乳链球菌CAU 0306，9 :金黄色葡萄球菌ATCC 25923，10 :水，11 =B1 :大肠埃希氏菌2002-1与B2 :大肠埃希氏菌J96混合，M DNAmarker0图4是本专利技术的试剂 盒敏感性检测结果图。图中1-6 :1 X IO6、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2、I X 101CFU/mL, M =DNAmarker具体实施例方式本专利技术中的生物材料来源的说明I、引物检测ompT基因的引物、检测chuA基因的引物、检测y j aA基因的引物、检测TSPE4.C2 基因的引物，分别命名为 ompT-l、ompT-2、chuA-Ι、chuA-2、yjaA-Ι、yjaA-2、TSPE4. C2-1、TSPE4. C2-2，是根据基因序列使用Oligo 6. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括IOXPCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，其特征在于所述的引物为 (1)检测ompT基因的引物 上游引物序列5' -GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3' (SEQ ID No. I) 上游引物序列5' -GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID No. 2) (2)检测chuA基因的引物 上游引物序列5' -GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' (SEQ ID No. 3) 上游引物序列5' -TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' (SEQ ID No. 4) (3)检测yjaA基因的引物 上游引物序列5' -TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' (SEQ ID No. 5) 上游引物序列5' -ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (SEQ ID No. 6) (4)检测TSPE4.C2基因的引...
【专利技术属性】
技术研发人员：佟春玉，崔玉东，宋佰芬，朱战波，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：
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