本发明专利技术属于生物检测领域。本发明专利技术提供了用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂。所述基因工程制剂包括三种重组牛分枝杆菌蛋白的混合物，该蛋白混合物能够刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应。本发明专利技术的基因工程制剂具有特异性高、生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉、可标准化生产等优点。利用所述检测试剂建立的皮内变态反应试验可提高实验灵敏度和特异性，可区分牛分枝杆菌感染和禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌感染，因此可有效用于牛结核病的临床检测。本发明专利技术还提供了用于制备所述基因工程制剂的引物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
本专利技术涉及用于牛分支杆菌感染检测的基因工程制剂及方法。
技术介绍
牛结核病(BovineTuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的ー种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内有5000万头牛感染了结核病，毎年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指 出“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，ー些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5. 83%和5. 43%ο近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10. 18%以上，甚至更高。牛結核菌素皮内变态反应试验(GB/T 18646)为世界动物卫生组织(OIE)规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified proteinderivatives, PPD),是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使pro检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且pro生产エ艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间pro质量的稳定。90年代后期发展起来的以pro为刺激原的Y -干扰素(interferon- Y，IFN- Y )释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN- Y，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-Y的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了結核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PH)作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性祀(The early secretedantigenic target6ku protein, ESAT-6)、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白 65 (Heatshock protein 65, HSP-65)、抗原 85B (antigen 85B, Ag_85B)、IOkDa 的培养滤液抗原(IOkDa culture filtrate antigen, CFP-10)等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)检测,通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。本专利技术人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了 Pro的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PF1D进行皮内变态反应实验和IFN-Y释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单ー抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的基因工程制剂及方法。本专利技术的专利技术原理为由于在皮内变态反应和Y-IFN释放试验中使用传统的PPD作为刺激原时，存在着成分复杂，特异性差的缺点，而现有用来替代pro作为刺激原的重组牛结核杆菌蛋白的敏感性不理想。本专利技术选择重组表达了牛分枝杆菌的三种特异性蛋白质CFP-10、ESAT-6和TB27. 4，其中CFP-10和ESAT-6属于同一个基因家族，具有相同的操纵子，两基因方向一致，共用一个启动子，协同表达，CFP-10的C端与ESAT-6相连，形成紧密的异ニ聚体结构，这种结构与细菌致病性和毒力有夫，TB27. 4蛋白与其他RDl区编码抗原一样可以在牛体内引起高水平的IFN-Y，并且据报道TB27. 4在人和豚鼠模型中相对于ESAT6、CFP-10而言，作为B细胞抗原比T细胞抗原更强些，由于TB27. 4与ESAT6、CFP-10的识别类型不同，本专利技术尝试用这些重组蛋白或其混合物替代Pro作为刺激原，提高牛分枝杆菌检测的敏感性。首先，本专利技术提供了用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11和SEQ IDNO:12。另ー方面，本专利技术提供了所述引物在在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。另ー方面，本专利技术提供了一种用于牛分枝杆菌感染检测的基因工程制剂，其中包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，所述重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN- Y。其中所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，所述三种重组蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: I、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:5 所示。本专利技术中，三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB27. 4的混合比例为I 2 Γ2 Γ2,包括但不限于I :1 :1、2 2 1和I :1 :2，其中优选为I :1 :1。本专利技术对所述三种重组蛋白及其混合物进行了皮内变态反应和IFN-Y释放试验，实验结果证明(I)本专利技术所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于pro作为刺激原的皮内变态反应试验和IFN- Y释放试验；(2)本专利技术所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于单一重组蛋白；(3)重组蛋白混合物作为刺激原时，其检测的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO :9和SEQ IDNO :10，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 1202.权利要求I所述引物在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。3.一种用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，所述重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN-Y。其中所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6的氨基酸序列。4.权利要求3所述的用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中所述三种重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO USEQ ID NO :3和SEQ ID N0:5所示。5.权利要求3所述的用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中所述三种重组蛋白的混合比例为I 2 : I 2 : I 2，包括但不限于I : I : I或2 : 2 : I或1:1:2。6.ー种试剂盒，其中包括权利要求3至5任一项所述的基因工程制剂和ELISA检测所需的包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗牛IFN-Y单抗等试剂。7.ー种制备权利要求3所述基因工程制剂的方法，该方法包括(a)用权利要求I所述的引物PCR扩增获得3种编码基因；(b)用大肠杆菌为宿主细胞重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾红，鑫婷，朱鸿飞，袁维峰，郭晓宇，侯绍华，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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