高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora?spinosa)野生菌株的基因组中整合有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。通过发酵验证，该基因工程菌的多杀菌素的发酵单位较野生菌株提高三倍以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，特别涉及一种。
技术介绍
多杀菌素是一种新型的绿色广谱生物杀虫剂，属于微生物源生物化学农药。多杀菌素兼有生物农药的安全性和化学合成农药的快速效果，喷药后当天即可见效，中国和美国农业部登记的安全采收期都只是一天，最适合无公害蔬菜的生产。因其低毒、低残留、对昆虫的天敌安全，自然分解快而获美国“总统绿色化学品挑战奖”。在日益注重环保和安全意识的今天，多杀菌素作为一种优质的绿色生物农药，有着巨大的发展和应用前景。目前多杀菌素生产主要采用生物发酵的方法，使用传统的自然选育，诱变育种等多种方法对多杀菌素产量的提高相对有限。多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的。多杀菌素分子结构中的两个糖基，即鼠李糖及福勒糖胺，它们有共同的前体NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖。该共同前体的合成步骤是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤。并且该共同前体的糖基合成基因——包括NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶(gtt) 基因和NDP-葡萄糖还原酶(gdh)基因——与刺糖多孢菌细胞壁中鼠李糖合成共用一套基因，不在多杀菌素PKS(polyketide synthases)基因簇中。陶氏益农公司的Krishnamurthy 教授通过同源探针，倍增了这个共同前体的整个cosmid合成基因，在野生菌株的基础上， 多杀菌素的产量有了显著的提高，但同时有一半的菌株由于大片段的转入，对多杀菌素PKS 产生影响，导致不产生多杀菌素。而在国内主要通过自然选育等传统方法提高其产量，在分子育种方面尚无突破性进展的文章。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的多杀菌素产生菌多杀菌素产量低的不足，提供一种多杀菌素产量更高的基因工程菌及其制备方法。本专利技术人经过广泛的研究和反复的试验，发现多杀菌素分子结构中的鼠李糖和福勒糖胺的共同合成前体的合成步骤是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤。因此，本专利技术人将该共同合成前体的两个合成酶基因——gtt基因及gdh基因，作为外源基因插入多杀菌素产生菌刺糖多孢菌的基因组中，并且使它们高效表达，惊喜的发现，这样得到的刺糖多孢菌突变株的多杀菌素产量大大提高，可见gtt基因及gdh基因的插入使所述的共同合成前体的合成步骤是不在是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤，从而提高了多杀菌素的产量，完成了本专利技术。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是一种高产多杀菌素的基因工程菌，其是在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株的基因组中整合有 NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。在基因组中整合入外源基因的表达盒，从而使插入的外源基因表达是现有技术， 一般是让该外源基因用启动子启动转录，终止子终止转录即可。本专利技术中整合入了 gtt及 gdh基因两个外源基因，可以使用同一个表达盒表达该两个外源基因，但是优选该两外源基因分别有自己的表达盒，这样表达更高效。因此根据本专利技术，如本领域常规的一样，所述的 NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子。所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。启动子可以启动基因的转录，从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此， 本专利技术中，所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在刺糖多孢菌中启动转录的启动子，优选刺糖多孢菌的强启动子，较佳的如红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列。本专利技术中，所述的基因gtt可以是任何编码NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的 NDP-葡萄糖合成酶的基因；所述的基因gdh可以是任何编码NDP-葡萄糖还原酶的基因。较佳的是来源于刺糖多孢菌&iccharopolyspora spinosa的gtt基因和gdh基因。可以是已知基因，如基因gtt是GenBank登录号AF35M67中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2的第238 1116位所示的序列，基因gdh是GenBank登录号AF35M68中的基因， 即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 3的第88 1074位所示的序列。本专利技术中，所述的基因gtt和基因gdh的表达盒在刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa)野生菌株的基因组中的整合位点可以是基因组中的任何位点，较佳的是整合位点是基因gtt或者基因gdh。本专利技术中，所述的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株可以是任何Mccharopolyspora spinosa属的野生菌株，都可以达到本专利技术的效果，优选刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa)NRRL 183950本专利技术还提供一种重组载体，其含有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒。本专利技术中，所述的gtt及gdh基因两个外源基因，可以使用同一个表达盒表达，但是优选该两外源基因分别有自己的表达盒，这样表达更高效。因此根据本专利技术，如本领域常规的一样，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子。所述的NDP-葡萄糖还原酶基因 gdh的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在刺糖多孢菌中启动转录的启动子，优选刺糖多孢菌的强启动子，较佳的如红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列。所述的基因gtt可以是任何编码NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶的基因；所述的基因gdh可以是任何编码NDP-葡萄糖还原酶的基因。较佳的是来源于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的gtt基因和gdh基因。可以是已知基因，如基因gtt是GenBank登录号AF35M67中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID N0. 2的第238 1116位所示的序列，基因gdh是GenBank登录号AF35M68中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID N0. 3的第88 1074位所示的序列。在本专利技术的重组载体中，所述的基因gtt和基因gdh较佳的是串联在一起的。本专利技术所述的重组载体的骨架可以是本领域的常规载体，优选质粒P0J260。质粒p0J260是穿梭质粒，可以在大肠杆菌中复制，也可以穿梭于放线菌刺糖多孢菌中。本专利技术的重组载体的制备方法可以采用本领域的常规的方法，将基因gtt和基因 gdh构建到表达盒中，克隆入载体即可。本专利技术还提供一种转化子，其含有本专利技术所述的重组载体。该转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主，优选大肠杆菌S17-1或者DH5ci。本专利技术还提供一种制备所述的高产多杀菌素的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高产多杀菌素的基因工程菌，其特征在于，其是在刺糖多孢菌Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ野生菌株的基因组中整合有ＮＤＰ－４－酮－６－脱氧－Ｄ葡萄糖的ＮＤＰ－葡萄糖合成酶基因ｇｔｔ的表达盒和ＮＤＰ－葡萄糖还原酶基因ｇｄｈ的基因的表达盒的工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种高产多杀菌素的基因工程菌，其特征在于，其是在刺糖多孢菌 Saccharopolyspora spinosa野生菌株的基因组中整合有NDP-4-酮_6_脱氧-D葡萄糖的 NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子；所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子是红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列；所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的编码序列是序列表中SEQ ID NO. 2的第238 1116位所示的序列；所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的编码序列是序列表中SEQ ID NO. 3的第88 1074位所示的序列。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的刺糖多孢菌 Sacc...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继安，邵雷，何泞君，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：31