抗肝癌活性单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肝癌活性单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank?accession?Number为AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸残基。本发明专利技术制备了高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性的鼠抗人GPC3-C单克隆抗体，为研究GPC3在组织和细胞中的表达和分布情况，深入研究GPC3蛋白的生物学功能以及肝癌的临床早期检测奠定了实验基础，并为治疗肝癌提供一种无毒性的辅助药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗肝癌活性单克隆抗体及其应用。
技术介绍
原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，目前在全球范围内其发病率呈上升趋势。我国是世界上肝癌发病集中的国家。肝细胞癌(HCC)预后极差，延长患者生存期的关键是早期诊断和早期治疗。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)在肝癌细胞中异常表达，而在正常肝细胞和其他非肿瘤肝病细胞表面未见表达。且在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、间皮瘤、肾癌等肿瘤中表达缺失，是潜在的肝癌特异性标志物。GPC3是一种细胞膜蛋白，分子量60～70kD。是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇结合于细胞表面。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC3)是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇结合于细胞表面。属膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胚胎及胎儿期负性调控组织器官的发育，出生后异常表达与肿瘤的发生发展关系密切。GPC3基因首先由Lage等人于1996年胃癌细胞系EPG85-257RNOV构建的λcDNA表达文库中分离克隆得到的。1997年Pila等在研究SGBS综合症时，发现这些病人的一个共同特点是出现X染色体与常染色体之间的转位。提示该区段含有重要的功能基因。Pila等分离克隆了该基因，命名为GPC3基因。GPC3蛋白相对分子质量约66kDa，其基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基化磷脂酰肌醇。GPC3在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成2段，使N-端约含40kDa的GPC3蛋白成为可溶性蛋白片段而分泌入血。在胚胎和胎儿期，GPC3的表达有明显的器官组织特异性和分化时相特异性。肝实质细胞在整个胎儿期均有明显表达，而出生后到成人阶段，除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无明显表达。成人GPC3异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切，在乳腺癌和卵巢癌中为表达缺失，在肾癌、肺鳞癌、甲状腺癌、梅克尔细胞癌、胃癌、大肠癌等呈过表达.在肝细胞癌早期，GPC3即呈高表达，并认为对HCC具有早期诊断价值(罗飞兵，张焜和.Glypican-3与原发性肝癌关系研究进展.世界华人消化杂志，2010，18(2)：155-159)。GPC3在肝癌组织与良性肝病组织的表达差异明显。Wang等(Wang XY，Degos F，Dubois S，Tessiore S，AllegrettaM，Guttmann RD，Jothy S，Belghiti J，BedossaP，Paradis V.Glypican-3expression in hepatocellular tumors：diagnostic valuefor preneoplastic lesions and hepatocellular carcinomas.Hum Pathol 2006；37：1435-1441)用基于组织芯片的免疫组织化学染色检测肝癌组织GPC3，发现有肝硬化背景的肝癌组织阳性率达90％，而正常肝脏背景下的肝癌组织阳性率为64％，肝脏腺瘤和早期肝癌组织阳性率为48％，良性结节或低级别腺瘤组织阳性率仅3％，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其他研究组不同的数据都表明，GPC3的表达与肝癌发-->生发展密切相关。GPC3抗体免疫组织化学和血清方法诊断肝癌在早期肝癌和AFP阴性的肝癌诊断中有一定的意义。然而多项研究表明GPC3在诊断肝癌中还存在诸多问题如：血清GPC3检测敏感性远不及组织学检测高；血清GPC3检测不能监测酒精性和非酒精性脂肪肝患者是否发展为肝癌患者等等。GPC3表达在肝细胞中的作用和参与的信号通路：正常肝细胞GPC3表达增加时，细胞分裂增殖下降，阻断GPC3表达则促进肝细胞生长.但在肝癌细胞则情况不同，GPC3表达不起负性调控作用。GPC3表达上调后可能通过激活整合素、胰岛素样生长因子和Wnt信号通路等促进肝癌细胞生长，增强细胞的迁移和侵袭能力。GPC3蛋白结构在第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被切割酶分成两个亚基：氨基末端蛋白(可溶性蛋白片段)和羧基末端蛋白(与包膜结合的蛋白片段)。氨基末端蛋白分泌入血，主要用于肝癌血清学检测；羧基末端蛋白位于细胞膜和胞质区上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗肝癌活性单克隆抗体以及其应用，本专利技术所提供的单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端第359-580位氨基酸残基。所述单克隆抗体的制备中所用免疫抗原是将所述GPC3抗原表位的编码基因插入pET32a的BamH I和Sal I位点之间获得的重组表达载体表达后纯化获得的融合蛋白；所述GPC3抗原表位的编码基因为自GenBank accession Number为L47125.15′端的第1226-1891位核苷酸序列。所述单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC№.4544的鼠源杂交瘤细胞株GPCC5#分泌的抗体。上述杂交瘤细胞株GPCC5#，已于2011年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC№.4544。该杂交瘤细胞株也属于本专利技术的保护范围上述单克隆抗体在制备检测和/或治疗肝癌的药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术首先表达和纯化了GPC3-C端(359-580aa)重组蛋白，所述的重组蛋白是设计引物，经过RT-PCR方法扩增HepG2提取的RNA方法，得到编码GPC3-C端(359-580aa)的基因。经过序列测定正确后，分别依据读码框连接入原核表达载体pET-32a和pGEX-4t-1载体中，构建两个相应的原核表达载体。表达纯化后免疫小鼠，筛选单抗，经过ELISA，WB和细胞免疫荧光鉴定后，最后鉴定获得了7株单克隆抗体。对鉴定的7株抗体进行抗肿瘤的ADCC实验结果发现7株抗体具有不同水平辅助ADCC的效能，特别是上述杂交瘤细胞株GPCC5#分泌的抗体，对肿瘤细胞的毒杀活性明显强于其他的6株抗体。本专利技术的抗体为鼠抗人GPC3-C单克隆抗体，具有高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性等优点，可以与细胞GPC3-C端(359-580aa)结合的抗体，抗体结合的特异性高，结合力强，可以通过ADCC作用杀伤肝肿瘤细胞。为研究GPC3在组织和细胞中的表达和分布情况，深入研究GPC3蛋白的生物学功能以及肝癌的临床早期检测-->奠定了实验基础，并为治疗肝癌提供一种无毒性的辅助药物。附图说明图1为pET32A-GPC3-C和pGEX-GPC3-C质粒的酶切鉴定。图中，A为pET32A-GPC3-C质粒的酶切鉴定，M为2kb DNA Marker，1-3均为鉴定的质粒，其中3号质粒正确.B为pGEX-GPC3-C质粒的酶切鉴定，M为2kb DNA Marker，1-3均为鉴定的质粒，1-3号质粒均正确。图2为TrxA-GPC3-C、GST-GPC3-C蛋白的原核表达。1为pET32a空载体对本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种单克隆抗体，是可以与ＧＰＣ３抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述ＧＰＣ３抗原表位的氨基酸序列为自ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ为ＡＡＡ９８１３２．１的氨基端端第３５９－５８０位氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的制备中所用免疫抗原是将所述GPC3抗原表位的编码基因插入pET32a的BamH I和Sal I位点之间获得的重组表达载体表达后纯化获得的融合蛋白；所述GPC3抗原表位的编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：周育森，李军锋，张慧娜，于虹，寇志华，陈万荣，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11