镇痛活性肽ＶＧＧ及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，涉及从天然材料提取、分离、纯化获得的镇痛活性肽ＶＧＧ及其制备方法、利用基因工程技术获得镇痛活性肽ＶＧＧ方法、镇痛活性肽ＶＧＧ衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法和镇痛活性肽ＶＧＧ及其衍生物、类似物、活性片段作为镇痛药物在医药领域中的应用。所述的镇痛活性肽ＶＧＧ是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨基酸序列：ＶＫＤＧＹＩＡＤＤＲＮＣＰＹＦＣＧＲＮＡＹＣＤＧＥＣＫＫＮＲＡＥＳＧＹＣＱＷＡＳＫＹＧＮＡＣＷＣＹＫＬＰＤＤＡＲＩＭＫＰＧＲＣＮＧＧ。所述的镇痛活性肽ＶＧＧ及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。本发明专利技术所述的镇痛活性肽ＶＧＧ具有较好的镇痛活性，其获得方法常规、简单、产量高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，涉及镇痛活性肽VGG的结构、获得方法以及其生 物活性与应用，具体地说，本专利技术涉及蝎镇痛活性肽VGG及其衍生物、类似物、活性片段的 结构及其制备方法，以及作为镇痛药物在医药领域中的应用。
技术介绍
蝎作为中医珍贵药材又称全虫、全蝎，始载于《开宝本草》，《本草纲目》列于虫部40 卷，距今已有2000多年的药用历史，具有熄风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功效。临床用于 治疗偏头痛、面神经瘫痪、风湿痹痛及癌痛等症，疗效确切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的 毒素，其中蕴涵大量具有药学价值的活性组分，是一个富含有多种功能肽的天然活性肽库。目前，从蝎或蝎毒中分离纯化并结构解析具有镇痛活性的成分还不是很多，如，蝎 镇痛抗肿瘤缬精甘肽、蝎镇痛抗菌活性肽等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供蝎镇痛活性肽VGG及其制备与应用，具体是利用蛋白提取、 分离、纯化技术，从蝎毒或蝎尾或全蝎中筛选、分离、纯化获得蝎镇痛活性肽VGG。镇痛活性 肽VGG获得方法简单易行，可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。本专利技术是从全蝎或蝎尾或蝎毒中，分离纯化筛选获得一种具有镇痛活性的新型结 构多肽。同时，利用基因工程技术或化学合成技术解决该活性肽的其他获得方法。此外，利 用基因工程技术或化学合成技术获得仍具有镇痛活性的该活性肽的衍生物或类似物或活 性片段。本专利技术中镇痛活性肽VGG，是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨 基酸序列VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。本专利技术的镇痛活性肽是通过如下技术方案实现的，它包括(1)原料(蝎毒或蝎尾 或全蝎)首先进行勻浆，利用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解抽提，离心除去不溶杂质 得到抽提液；(2)该抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同 组合以及经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到镇痛活性肽VGG ； (3)经反向层析柱得到高纯度 的镇痛活性肽VGG。比如，蝎毒经酸性溶液溶解，离心除去不溶杂质得到抽提液；抽提液经 疏水层析柱分离得到镇痛活性组分I ；得到镇痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时 进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到镇痛活性组分II ；经疏水层析柱进一步分离得到 镇痛活性组分III ；经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到镇痛活性组分 IV ；经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到镇痛活性肽VGG ；经反向层析柱得到高纯度的镇痛 活性肽VGG。本专利技术目的之二是提供多种镇痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或类似物的 制备方法，它包括利用基因工程技术进行表达或通过化学合成获得。本专利技术所述的获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也为工业化生产奠定了基础。本专利技术的另一个目的是提供了通过基因工程方法生产上述镇痛活性肽VGG及其 部分片段或衍生物或类似物的制备方法，该方法包括(1)将镇痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载 体；(2)用步骤(1)的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的蛋白质。本专利技术提供上述镇痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分 离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤 等方法以及上述方法的组合，从细胞的溶胞产物或其培养液中分离并纯化所需的表达产 物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测表达产物的存在 及相应分子大小。本专利技术首次进行上述镇痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或类似物的小鼠体 内镇痛生物学活性实验。本专利技术还提供了上述镇痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或类似物在生物制 药领域的应用，具体地说包括镇痛生物活性。本专利技术的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受 的载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠 道夕卜途径给药的药物组合物(^nSMRemington' sPharmaceutical Science, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔 内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本专利技术的药物组合物。本专利技术的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。可使用 本专利技术的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼 痛相关疾病。本专利技术的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对 药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。在本专利技术中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞等。具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本专利技术，而不是以任何方式限 制本专利技术特批权利要求的范围。实施例1 从蝎毒获得镇痛活性肽VGG获得镇痛活性肽VGG的提取、分离、纯化体系基本条件的特征1.操作温度在 O0C -45°c ；2.溶液的酸碱度在PH2-PH12，优选酸碱度范围在PH5-PH9。上述条件既不破坏 提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响镇痛活性肽VGG的活性。(1)镇痛活性成分的抽提通过如下三种方法抽提镇痛活性成分A.蝎毒溶于蒸馏水后，15000转/分离心15分钟，取上清液用0. OlM盐酸或磷酸 溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，取上清液用碱性溶液调pH为12，15000转/分 离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性成分的抽提液。B.蝎毒溶于pH为2的缓冲溶液或酸性溶液，15000转/分离心15分钟，取上清液 用碱性溶液调pH为12，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性成分的抽提液。C.蝎毒溶于pH为12的缓冲溶液或碱性溶液，15000转/分离心15分钟，取上清液 用酸性溶液调PH为2，15000转/分离心15分钟，上清液为蝎毒镇痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸碱度从pH2_pH12，均不影响镇痛活性成分的生物活性，且从原料 中能够提取活性成分。 (2)镇痛活性肽VGG的疏水层析分离取上述镇痛活性成分的抽提液，用盐酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或碱性溶 液调PH至优选条件范围(优选pH值范围在pH5-pH9)下，加中性盐至2M浓度，上样于预先 用2M中性盐-缓冲液平衡的疏水层析柱，分别用2. 0M、1. 5M、1. 0M、0. 5M中性盐-缓冲液洗 脱，最后用缓冲液洗脱，将含有镇痛活性的洗脱液合并_镇痛活性成分I。疏水层析分离的特征1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水 层析添料或己烷-疏水层析添料或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(NH4) #04或Na2SO4 或NaCl，当疏水层析洗脱液酸碱度在微碱性与酸性条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
镇痛活性肽ＶＧＧ，其特征在于，它是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨基酸序列：ＶＫＤＧＹＩＡＤＤＲＮＣＰＹＦＣＧＲＮＡＹＣＤＧＥＣＫＫＮＲＡＥＳＧＹＣＱＷＡＳＫＹＧＮＡＣＷＣＹＫＬＰＤＤＡＲＩＭＫＰＧＲＣＮＧＧ。

【技术特征摘要】
镇痛活性肽VGG，其特征在于，它是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的如下氨基酸序列VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。2.一种如权利要求1所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，通过提取、分离、纯化获得，其 特征在于，它包括如下步骤(1)蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质 得到抽提液；(2)抽提液经疏水层析柱分离得到镇痛活性组分I；(3)得到镇痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱 分离得到镇痛活性组分II ；(4)经疏水层析柱进一步分离得到镇痛活性组分III；(5)经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到镇痛活性组分IV；(6)经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到镇痛活性肽VGG；(7)经反向层析柱得到高纯度的镇痛活性肽VGG。3.根据权利要求2所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，由蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸馏 水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取并经离心除去不溶杂质得到的抽提液，该抽提液可以通 过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及经超滤去除盐、杂蛋白和 浓缩得到镇痛活性肽VGG，层析柱使用的不同组合特征在于，疏水层析柱-离子交换层析 柱_疏水层析柱_离子交换层析柱_凝胶过滤，或凝胶过滤_疏水层析柱_离子交换层析 柱_疏水层析柱_离子交换层析柱，或离子交换层析柱_疏水层析柱_离子交换层析柱_疏 水层析柱_凝胶过滤，或凝胶过滤_离子交换层析柱_疏水层析柱_离子交换层析柱_疏 水层析柱，或疏水层析柱_离子交换层析柱_疏水层析柱_凝胶过滤_离子交换层析柱等 等的组合。4.根据权利要求2或3所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，其特征在于，操作温度 O0C -450C ；溶液、缓冲溶液、层析洗脱液的酸碱度在pH2-pH12。5.根据权利要求2或3所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，其特征在于，步骤(2)是将 镇痛活性成分的抽提液，用盐酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或碱性溶液调PH至优选 酸碱度为pH5-pH9下，加中性盐至2M浓度，上样于预先用2M中性盐-缓冲液平衡的疏水层 析柱，分别用2. OMU. 5M、1. 0M、0. 5M中性盐-缓冲液洗脱，最后用缓冲液洗脱，将含有镇痛 活性的洗脱液合并。6.根据权利要求2或3所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，其特征在于，步骤中疏水 层析介质选自苯基_疏水层析添料或正辛烷_疏水层析添料或己烷_疏水层析添料或丁 烷-疏水层析添料；中性盐选自(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl ；中性盐浓度在2. 0M-1. OmM ； 缓冲液的浓度为ImM-IOOmM;洗脱模式是阶段洗脱或梯度洗脱；梯度洗脱的中性盐浓度在 2. 0M-1. OmM07.根据权利要求2或3所述的镇痛活性肽VGG的制备方法，其特征在于，步骤的透过镇 痛...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景海，杨倬，刘岩峰，吴春福，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]