本申请涉及重组人ｈｆｇｌ２微小核糖核酸在肝癌中的应用，即构建肝癌相关的人ｆｇｌ２（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ｈｆｇｌ２）凝血酶原酶基因的微小ＲＮＡ腺病毒表达颗粒，在肝癌中进行治疗并验证其药学用途。利用腺病毒介导的ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ干扰技术即利用重组人ｈｆｇｌ２微小核糖核酸（ｈｆｇｌ２－ｍｉＲＮＡ腺病毒注射液）靶向治疗肝癌，利用已建立的高侵袭性人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，瘤内多点注射重组人ｈｆｇｌ２－ｍｉＲＮＡ腺病毒注射液，通过比较肿瘤大小及免疫组化等方法探索ｈｆｇｌ２－ｍｉＲＮＡ腺病毒注射液的优化治疗剂量，结果发现疗效显著，表明ｈｆｇｌ２的沉默对肝癌的治疗具有潜在的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝癌的基因治疗方法，更特别涉及使用hfgl2抑制剂治疗肝癌， 尤其是涉及重组人hfgl2微小核糖核酸在制备治疗肝癌药物中的应用，即构建人 fgl2 (HumanFibrinogen-like protein 2，hfgl2)凝血酶原酶基因的微小RNA腺病毒表达 颗粒，在肝癌中进行治疗并验证其药学用途。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病。我国每年癌症发病人数约160万。恶 性肿瘤正超过心血管病成为致死原因的第一位。癌症的防治和研究正成为全世界科学家日 益关注的课题。凝血和血管新生是肿瘤发生、发展的重要途径之一。血栓与肿瘤的关联早在1865 年就被法国学者Armand Trousseau观察到了。临床研究表明血栓形成是目前癌症患者最 常见的并发症和第2位死亡原因。其机制的揭示则在近些年，多数学者认为有两条途径组 织因子和凝血酶，它们可通过凝血依赖和凝血非依赖途径导致肿瘤血栓形成，这对于肿瘤 生长和转移是必需的。其中，凝血酶可通过凝血依赖途径切割纤维蛋白原，结成交联的纤维 蛋白沉积于血管内和细胞外基质。纤维蛋白能增强肿瘤细胞对血小板的黏附及细胞外基质 的侵袭并引发体内的转移，还能包裹肿瘤细胞保护其免受宿主免疫系统攻击，或形成一种 临时的支架结构促进内皮细胞迁移以及新生血管腔形成；凝血酶作用的凝血非依赖途径主 要通过切割细胞表面结合的蛋白酶激活受体(protease activated rec印tors，PARs)从而 激活信号转导途径，促进肿瘤细胞的有丝分裂和对一些细胞因子的增殖反应而实现。血管 新生是肿瘤生长和转移的重要条件，而凝血酶是血管形成的有效促进剂。凝血酶在细胞水 平上促进血管生成的作用包括①降低内皮细胞对基底膜蛋白的黏附能力；②增强VEGF引 起的内皮细胞增殖，这一过程伴随VEGF受体表达上调；③多种促进血管生成的相关基因上 调(VEGF、bFGF、TF、MMP-2等)。这些作用继而引起一系列细胞反应，如可以使内皮细胞形态 改变(易于包绕成环)、血管通透性增加、内皮细胞增生及蛋白酶水解作用增强。当肿瘤体 积超过12mm3时，维持其继续生长就有赖于新生血管的生成。这些新生血管把肿瘤细胞和循 环系统直接连结起来，使得供肿瘤生长的物质交换得以进行。此外新生血管还可作为肿瘤 转移的通道，通过新生血管将原发癌细胞输送到转移靶器官。因此，血管生成是肿瘤生长转 移的必由之路，与实体瘤的发生、转移具有密切关系。研究血管生成对了解恶性肿瘤发生、 发展、侵袭、转移的生物学特性及针对肿瘤血管生成的基因治疗有重要意义，是极具应用前 景的新型肿瘤治疗靶点，且抗血管生成治疗不产生耐药性，并已广泛应用于科研和临床。动 物研究和临床研究都发现抗血管生成治疗能够部分甚至完全抑制肿瘤转移。抗血管生成治 疗和传统细胞毒药物相结合可望在肿瘤治疗上有所突破。恶性肿瘤患者普遍存在的高凝状态对肿瘤的发生发展及复发转移至关重要。肿 瘤细胞自身、宿主炎性细胞和肿瘤相关内皮细胞的促凝活性增加是产生高凝的主要原因之 一。上述细胞的促凝活性增加是由于细胞表达促凝物引起，包括肿瘤细胞分泌的癌性促凝物(cancerprocoagulant，CP)及肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和浸润的巨噬细胞表达的组 织因子(tissuefactorJF)。近年来发现的人纤维介素(hfgl2，f ibroleukin)，属于纤维蛋 白原家族成员，在某些病理情况下，表达于活化的巨噬细胞、内皮细胞和淋巴细胞等免疫活 性细胞表面。它具有丝氨酸蛋白酶活性，能直接裂解凝血酶原成为凝血酶，被称为“免疫凝 血”。用病毒、细菌脂多糖(LPS)等刺激小鼠巨噬细胞表达小鼠纤维介素(mfgl2)后，巨噬 细胞表现出明显的促凝活性(PCA)。hfgl2与mfgl2的氨基酸同源性大于70%，尤其羧基端 225个氨基酸同源性超过90%。肝癌为典型的多血管肿瘤，是危害人类健康的重要恶性肿瘤之一。我国是肝病大 国，患者高达3000万，每年因各种肝病死亡的人数达30万。流行病学调查显示病毒性肝 炎约有10%发展为慢性活动性肝炎，而慢性活动性肝炎有50%发展为肝硬变，肝硬变癌变 率大约10-20%左右。进入20世纪90年代以来，原发性肝癌已成为我国第二位癌症杀手。目前针对肝癌的治疗主要采用早期手术切除、晚期化疗，同时辅以放疗和免疫制 剂注射的传统方案，以及新兴起的基因治疗。在临床上传统的治疗方案尽管能缓解早期患 者的病情，但毒副作用大，对中晚期及转移复发性患者疗效较差。基因治疗有望克服传统治 疗的弊端，成为肝癌生物治疗新途径。然而肝癌的基因治疗迄今仍未获得突破性进展，目前 尚需解决的主要问题是1)寻找针对肿瘤特异性的理想靶基因由于肿瘤的发生涉及多基 因，针对某一癌基因或抗癌基因的策略难以有效控制肿瘤的恶性生长，对于肝癌的基因治 疗而言尤其如此，所以可选用的理想靶基因较少。2~)外源基因选择性转运至靶组织肿瘤 基因治疗的另一难点是靶向导入问题，迄今所发现的多数肿瘤相关靶分子其靶向特异性均 不高。幻清除肿瘤微小病灶与控制其转移任何转基因技术，不可能使体内所有肿瘤细胞 被转染，单纯的基因治疗亦难以清除体内尚未转染基因的肿瘤细胞。重组腺病毒载体是当前基因治疗中所用的重要载体之一。以腺病毒为基础构建 基因转移载体具有以下优点(1)人类是腺病毒的天然宿主，所以比较安全；( 该病毒宿 主范围广泛，能将目的基因转移到分裂或静息的细胞中；(3)由于腺病毒感染细胞时其DNA 不整合到宿主染色体中，潜在的致癌危险小；(4)外源基因表达水平较高，滴度高，在体外 稳定，易于制备与纯化。尽管如此，腺病毒载体的安全性、靶向性及有效性依然是基因治疗 中始终关注的内容，目前国内外研究结果表明，腺病毒载体具有较强的免疫原性及一定的 细胞毒性，如使用剂量过大，可引起严重的不良反应，但若控制好注射剂量和病人的基础情 况，采用局部给药的方式则基本上是安全的，临床常见不良反应为发热、寒战和局部反应寸。腺病毒感染细胞的过程从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开 始，该特异性受体即柯萨奇/腺病毒受体CAR(coxsackie/adenovirus receptor)。CAR分 布广泛，且不同种属、组织的分布不同，人类CAR在心脏和胰腺中表达最强，脑、小肠、睾丸、 前列腺也有较高表达，肝脏、肺次之，而肾、外周血白细胞、胸腺和脾脏则未见表达。CAR介导 的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面CAR表达水平有 关。
技术实现思路
专利技术人从研究肿瘤血管形成对肝癌生长和转移作用的角度出发，研究人类肝癌患者组织标本，并以肝癌动物模型为技术平台，探索抑制肿瘤血管新生和血栓形成对防治肝 癌的作用，发现抑制或沉默hfgl2，能显著抑制肿瘤细胞，尤其是肝癌细胞生长和转移，对肝 癌的治疗效果显著，从而完成了本专利技术。专利技术人研究了人类肝癌患者组织标本，发现在肝癌组织中hfgl2的表达增高，以 裸鼠肝癌动物模型为技术平台，利用micro RNA干扰技术沉默hfgl2，发现hfgl2蛋白质水 平和mRNA水平受到抑制后，显著影响裸鼠人肝癌荷瘤模型中皮下肿瘤的发生和发展，沉默 hfgl2可以抑制肿瘤，尤其是抑制肝癌生本文档来自技高网...
【技术保护点】
ｈｆｇｌ２凝血酶原酶的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宁琴，罗小平，习东，王鸣，严伟明，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83
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