用于Ｈ５亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断ＥＬＩＳＡ制造技术

对流感Ｈ５亚型ＨＡ蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋白可用于血清学诊断哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感Ｈ５感染。每种抗体均与多种Ｈ５亚型株强烈反应，但不显示与非Ｈ５流感亚型的交叉反应性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及开发一种用于检测禽流感病毒抗体的特异性血清学分析。更具体 地，本专利技术涉及单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体与所有已知的H5流感病毒亚型强烈 反应，但不与非H5流感亚型交叉反应，其用于开发用于检测人和非人动物中H5流感亚 型的血清抗体和相关结合蛋白的表位阻断ELISA。
技术介绍
禽流感病毒(AIV)是禽类常见疾病。1996年在中国广东省饲养的鹅中发现第一 例家禽的H5N1亚型AIV的感染，1年后在香港发现第一例人的H5N1亚型AIV感染。 从那时起，H5mAIV造成禽流感的爆发，其波及世界许多地区。迄今为止受影响的地区 包括欧洲，中东和特别是亚洲。根据世界卫生组织(WHO)的最新报告，总共有328 例确认的人H5N1禽流感病例，其中200例导致患者的死亡。在这328个病例中，据报 道绝大多数(106例，85例死亡)来自印度尼西亚。根据WHO，基于病毒进化为 能够有效的在人与人之间传播的毒株，全球现在处于大范围流行警报的第3级(共6级) 。在2006年6月，印度尼西亚33个省中的27个报道了家禽中H5N1的爆发，导 致超过1600万只家禽因为患病和扑杀而死亡。养禽业因为禽流感损失数百万元。这 种损失影响了数百万靠家禽维生的人的收入。HPAICH5N1)在家禽中的这种爆发以及现 在人类中病例数的增加引起大家的关注。在爆发初期准确并及时检测病原体存在的能力 将大大有利于控制疾病。此外，它可以减少抗生素滥用并以及时方式提供使用抗病毒治 疗的选择。可用于流感诊断的各种方法包括病毒分离，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的 病毒抗原检测，通过RT-PCR的分子检测和血清测试。标准病毒分离步骤具有需要数天 来获得结果的缺点，从而限制了临床医生对其的使用。RT-PCR的缺点包括涉及的高成 本，技术熟练人员的要求，污染的可能性以及假阳性结果的后续风险。此外，因为抗原 性漂移，PCR引物可能需要持续更新。病毒中和，血细胞凝集抑制(HI)，ELISA和 免疫印迹测试是血清学诊断的优选方法。但是，中和测定和HI测定不被认为是高度灵敏 的和需要进一步进行亚型分析，并且是高劳动强度和耗时的,因此不适于血清的 大规模常规检验。ELISA已经被广泛用作研究大量样品的预筛选工具，但市场上只能买 到针对鸡和火鸡血清的间接ELISA系统，因为没有提供其他物种的种特异性二抗。间接 ELISA的进一步限制是要求高的抗原纯度。但是，间接ELISA的最显著缺点在于已知HA 抗原与病毒的其他亚型交叉反应。因此，间接ELISA不是可靠的检测方法。大部分这些方法不仅是麻烦和高劳动强度的，并且耗时和包括获得假阳性结果 的风险。这些技术的进一步限制是流感病毒是碎裂的基因组RNA病毒，已知其经历连续 的突变和遗传重组(抗原性漂移)，使其难于检测病毒。4考虑到这些常规测定的缺点，并且因为AIV感染对野生动物、家养动物和人的 风险，急需一种新的测定法，其能快速、易用和特异性的用于检测AIV的H5亚型。本 专利技术代表了在AIVH5亚型的诊断和监测方面的突破。专利技术概述根据本专利技术，提供了对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋 白。所述抗体可用于哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染的血清学诊 断。更具体地，每种抗体可用于高灵敏和特异性表位阻断ELISA以检测人和其他动物中 的流感H5亚型。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应但不显示与非H5流感亚型的交 叉反应性。因此，本专利技术包括与禽流感病毒H5亚型的表位结合的结合蛋白，其基本上具有 单克隆抗体5F8或单克隆抗体1G5的免疫结合特性。结合蛋白可以是单克隆抗体、抗体 片段、嵌合抗体或人源化抗体和优选是单克隆抗体。本专利技术还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为CNTKCQTP的AIV H5血凝素的表 位结合。本专利技术还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为IHPLTIGE的AIVH5血凝素的表位结合。另一方面，本专利技术包括一种检测生物样品中H5亚型AIV的方法，其包括将样 品与包含H5亚型血凝素糖蛋白的表位的抗原接触并确定样品中的抗体是否结合所述表 位。优选通过表位阻断ELISA进行结合确定。优选H5亚型血凝素糖蛋白的表位包括序 列CNTKCQTP或序列IHPLTIGE。IHPLTIGE和CNTKCQTP表位存在于所有已知的人 H5N1 AIV株、基本上所有已知的鸡H5N1AIV株和基本上所有已知的其他动物和禽类的 H5N1株中，并且是非常稳定和高度抗原性的，使其非常适用于诊断H5N1感染。本专利技术还涉及检测生物样品中H5亚型AIV感染的试剂盒，其中所述试剂盒包括 结合H5亚型AIV包膜糖蛋白的表位的结合蛋白以及用于检测所述结合蛋白与所述表位 结合的试剂。在优选实施方案中，所述表位包括序列CNTKCQTP。在另一优选实施方 案中，所述表位包括序列HPLTIGECPK。在优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有 mAb 5F8的免疫结合特性。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有mAb 1G5 的免疫结合特性。附图简述附图说明图1A-1B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 5F8的表征。图 1A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 5F8对H5N1 AIV感染的MDCK细胞中天然HA1和杆 状病毒表达的rHAl的识别。分别用H5亚型和重组杆状病毒感染MDCK和Sf_9细胞。 对照是H9N2感染的MDCK细胞和Sf_9细胞。图1B显示Western印迹中MAb 5F8对H5N1AIV的识别。通过SDS-PAGE分析从尿囊液纯化的AIV H5N1 (第1-9道)，H5N2 (第10道)和H5N3 (第11道)，并将 其固定于硝酸纤维素膜。显示对H5亚型的抗体特异性的MAb 5F8不识别阴性对照(无 病毒)，H3N2(第 12 道)，H7N1 (第 13 道)HA。图 2A，2B, 2C 禾口 2D。MAb 5F8 的表位作图。图2A显示用于表位作图的策略。从A到E和SF1到SF8的全部指明片段作为 His融合蛋白表达。图2B显示片段A到E的Western印迹分析，使用MAb 5F8作为一抗。C:rHAl蛋白用作对照。图2C显示8个进一步截短肽(SF1-SF8)的Western印迹 分析结果，所述截短肽是图2A片段4的延伸但在片段5区域截短并作为组氨酸融合肽表 达。图2D显示也作为组氨酸融合肽表达的点突变的Western印迹分析结果。进行分析 以确定针对mAb 5F8的表位的氨基酸序列。图3A和3B显示相对于免疫鸡血清造成的CDC/523/H5HA1表位或rH5HAl 的mAb结合的50%阻断。结果表示为百分阻断值的算术平均值(n = 5/组+标准误差 (SE))。图4A-4B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 1G5的表征。图 4A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 1G5识别H5N1AIV感染的MDCK细胞和Sf_9感染杆 状病毒中的天然HA。分别用H5病毒或重组H5HA杆状病毒感染MDCK和Sf_9细胞。 对照是H4N1感染的MDCK细胞和Sf-9细胞。图4B显示Western印迹中mAb 1G5对H5HA的识别。所述单克隆抗体识别第 1-14道每条中的H5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与禽流感病毒Ｈ５亚型的表位特异性结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗体５Ｆ８的免疫结合特性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：P木根，NP帕杜比德里，S韦卢马尼，HSJ康，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：SG