本发明专利技术抗传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ４蛋白单克隆抗体属于生物技术领域，涉及基因工程。将ＩＢＤＶ ＶＰ４基因克隆于原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达；分离包涵体，用８Ｍ尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得ＶＰ４重组蛋白。用ＶＰ４重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行细胞融合，以ＨＡＴ培养基选择性培养后，以ＶＰ４重组蛋白和ＩＢＤＶ感染细胞进行双重ＥＬＩＳＡ筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗ＩＢＤＶ ＶＰ４蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中４Ｃ３、６Ａ４和６Ｈ８腹水的ＥＬＩＳＡ效价分别为：６．４×１０↑［５］、２．６×１０↑［６］和５．２×１０↑［６］，均能特异识别ＩＢＤＶ感染细胞的病毒蛋白，其Ｉｇ亚型重链为ＩｇＧ１，轻链为κ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及抗体工程技术，具体为抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白 单克隆抗体。技术背景传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)是传染性法氏囊病(IBD)的病 原，主要侵害3-6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，破坏表面带有sIgM的B淋巴细胞，并引 起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡，导致以淋巴细胞衰竭、坏死为主要特征的免疫缺 陷性和免疫抑制性疾病。该病发病率高，病程短，除疾病自身可造成机体损伤外，还可导致 多种疫苗免疫失败，严重危害养禽业的健康发展。IBDV属双RNA病毒科(S!VmmWA^)禽双 RNA病毒属04础/maw'n^),无囊膜，具有单层衣壳，呈20面体立体对称，病毒基因组由双 链双节段RNA组成，大节段A全长3259个核苷酸，含有两个部分重叠的开放阅读框架(ORF)， 大ORF全长共3036个核苷酸，按NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的顺序编码分子量为110 kDa 的多聚前体蛋白(VP2/4/3)，并剪切加工成为VP2蛋白前体(pVP2)、 VP3和VP4蛋白，pVP2 进一步加工成为成熟的VP2蛋白和4条多肽(pep46、 pep7a、 pep7b和pepll);小ORF全长共 435_447个核苷酸，编码VP5非结构蛋白。小节段B全长2827个核苷酸，只有一个ORF编 码VP1蛋白。VP4由243个氨基酸组成，分子量约为28kDa,属于丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白活性， 主要作用是对多聚前体蛋白VP2/4/3进行自我水解，使之水解成为pVP2、 VP3和VP4三种 病毒蛋白，其中pVP2-VP4VP4-VP3确切剪切位点分别定位于L512A丄A513和 M755AiA756。此外，VP4还能激活VP1的合成，与病毒在感染细胞后形成的微管状结构有关，有可能也参与了病毒组装，但不诱导凋亡。由于IBDV病毒粒子不存在VP4蛋白，无法 获得自然状态下的VP4病毒蛋白，严重制约VP4蛋白特性和功能的研究，利用VP4重组蛋 白制备特异性单克隆抗体可为VP4研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨VP4蛋白在IBDV 病毒粒子形成及其致病方面的作用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，能特异识别IBDV感染细胞病毒蛋白的单克隆抗体。IBDVVP4重组蛋白是将IBDVVP4 基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M 尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表达蛋白。 该单克隆抗体的具体制备方法如下1 、根据IBDV VP4基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长VP4基因。 将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达IBDV VP4蛋白；裂解表达菌体，分离包涵体，用8M尿素溶液溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析 纯化，获得IBDVVP4重组蛋白。2、 用IBDV VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞 融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛 选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤 细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体特性 进行鉴定。3、 以ELISA测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴 定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚类。本专利技术的优点是(1)本专利技术提供的IBDVVP4重组蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本 专利技术提供抗IBDVVP4蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗IBDVVP4蛋白单 克隆抗体可用于VP4蛋白的特性和功能研究。 附图说明图1为IBDV VP4重组表达质粒pET28a-VP4的鉴定图，图中1是阴性对照，2是质粒 pET28a-VP4的PCR产物，3是100 bp DNA ladder。图2为IBDV VP4表达蛋白的SDS-PAGE鉴定图，图中1是蛋白质Marker, 2是 BL21(DE3)/pET-28a诱导表达菌体，3是BL21(DE3)/pET28a-VP4诱导表达菌体。图3为抗VP4蛋白单克隆抗体的IFA鉴定图，图中A和B分别是单克隆抗体6A4与IBDV NB株感染及正常鸡胚成纤维细胞(CEF)的反应结果，C和D分别是单克隆抗体6H8与IBDV NB株感染及正常CEF的反应结果，E和F分别是单克隆抗体4C3与IBDVNB株感染及正常 CEF的反应结果。具体实施方式1、 IBDV VP4重组蛋白的制备根据IBDV NB株A节段核苷酸序列设计引物，PCR扩增IBDV VP4基因，将其克隆于原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG 诱导表达IBDV VP4蛋白；收集表达菌体，冻融3次后，离心分离包涵体，用8M尿素溶液 溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析纯化，获得IBDVVP4重组蛋白。2、 抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体的制备用等量弗氏佐剂乳化纯化的VP4重组蛋白， 免疫6-8周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合， 用HAT培养基进行选择性培养；以纯化的VP4重组蛋白和IBDV感染CEF裂解物为检测抗 原，用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法 克隆化，获得稳定分泌抗VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以降殖烷致敏BALB/c小鼠 后，将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水，获得抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体。3、 抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的特性鉴定以纯化VP4重组蛋白为检测抗原用间接 ELISA方法测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价；以间接免疫荧光鉴定抗IBDV VP4 蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性；用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亚型测定试剂盒鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体重链和轻链的Ig亚型。实施例1 IBDV VP4重组表达质粒的构建根据IBDV NB株A节段核苷酸序列(EF517528.1)设计合成特异性引物，上游引物 5，-CGTCGTCCATGGCCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3，(下划线为iVcoI位点)，下游引物 5'-CGTCGTCTCGAGCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3,((下划线为Jftol位点)。以PCR 从IBDV A节段质粒中扩增IBDV VP4基因，引入TVcoI/^zoI酶切位点，PCR产物经Wcol/^zol 双酶酶切消化后，连接到原核表达载体pET-28a的iVcoI/J^oI位点间，转化大肠杆菌Topl0, 提取转化细菌的质粒，以PCR鉴定重组表达质粒(图1)，经本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ４蛋白单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是用纯化的ＩＢＤＶＶＰ４重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，特异识别ＩＢＤＶ感染细胞中的ＶＰ４病毒蛋白的单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，王永志，郭军庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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