本发明专利技术公开了一种腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白的制备方法，首先从腺病毒提取腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白作为抗原，其次经组织培养制备的病毒抗原，以不连续梯度密度离心纯化抗原，然后用所制备的纯化抗原，建立筛选高效价腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白的方法，及体外中和病毒试验等。最后用低温乙醇方法或离子交换层析法方法或亲和层析法在具有高效价腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒学和免疫学领域，涉及一种药物制备方法，特别涉及一种用于预防和治 疗的腺病毒抗体的制备方法。更具体地说，本专利技术涉及通过免疫动物或人的能够产生腺病毒 特异性免疫球蛋白的抗原物质的来源、腺病毒特异性免疫血浆或体液的筛选方法以及腺病毒 特异性免疫球蛋白的分离提纯等的制备方法。二、
技术介绍
腺病毒(Adenovirus)是一群分布十分广泛的DNA病毒。能引起人类呼吸道、胃肠道、 泌尿系及眼的疾病。少数对动物有致癌作用。腺病毒分为感染鸟类和哺乳动物的两个属。人 类腺病毒根据物理、化学、生物学性质分为A G7组，每一组包括若干血清型，共42型。人 腺病毒中部分型别有致病性，最常的是1 7型。幼儿急性上呼吸道感染约5%由腺病毒引起， 成人感染很少发生于呼吸道，传播以粪一口为主途径，也可通过呼吸道或污染物品传播。 病毒在咽、结膜尤其是小肠上皮细胞内增殖，偶尔波及其他脏器，隐性感染常见。疾病一般 为自限性，感染后可获得长期持续的型特异性免疫力，中和抗体损伤作用重要。A、 B组病 毒在某些新生动物可诱发肿瘤，对人未发现致癌作用。腺病毒一般通过呼吸道传染。在集体 儿童机构中往往同时发生腺病毒上呼吸道感染及肺炎。人群血清学研究说明，生后最初数月 常存留从母体传递的腺病毒特异抗体，此后一直到2岁抗体缺乏，2岁以后才逐渐增加。这 与腺病毒肺炎80%发生在7 24月婴幼儿的临床观察完全符合。值得注意的是当地各年龄组 易感人群数量越多，发生腺病毒呼吸道感染的人数就多，而婴幼儿发生腺病毒肺炎的机会也 越大。腺病毒肺炎在我国北方多见于冬春两季，夏、秋季仅偶见，在广州的高流行年则多见 于秋季。这类肺炎在北京约占病毒性肺炎的20% 30%。100多个型别的腺病毒构成了含有哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)和禽腺病毒 (Aviadenovirus)两个属的腺病毒科(Adenoviridae)，每个病毒属中所有成员间均具有共同 的属抗原(抗原决定簇位于六邻体蛋白)，而不同的病毒属成员间无抗体交叉反应。腺病毒 颗粒直径60 90nm，没有囊膜，20面体立体对称，衣壳由252个克微粒组成，其中240个 壳微粒是六邻体(Hexon),具有组特异性a抗原。位于20面体顶端的12个克微粒是五邻体 (Penton)。每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成。基底具有毒素样活性，能引起细胞病变，并使细胞从生长处脱落，具有同组共有的6抗原。纤维与病毒凝集 大白鼠或恒河猴红细胞的活性有关，是型特异性Y抗原所在。核酸为以股线状DNA，分子 量20 30X106道尔顿。(1) 、六邻体蛋白，腺病毒六邻体的沉降常数在13s左右，由3个相同的亚基组成，每 个多肽的分子量为108kD。六邻体蛋白富含二羧基氨基酸，其氨基末端乙酰化。各型病毒株 间六邻体蛋白氨基酸序列的同源性非常高。六邻体蛋白能够刺激机体产生中和抗体以及组和 型特异性抗体。(2) 、五邻体蛋白，五邻体在形态上与六邻体相似，为球状结构，直径平均为8nm,沉 降系数大约是9.5s，分子量在246 256kD之间。五邻体同样是一个同源三聚体，每个亚基 的分子量为85kD，对蛋白酶较为敏感，不同毒株间五邻体蛋白氨基酸序列的同源性较高。五 邻体蛋白参与与病毒与细胞的互相识别以及病毒的吸附和穿入过程。(3) 、纤维蛋白，腺病毒的纤维蛋白结构不对称，由蛋白质的氨基端至羧基端依次排列 着与五邻体基座区非共价结合的尾部、柄及顶端球形结3个结构域，枘与球形结的直径分别 为2nm和4nm，纤维蛋白也属于同源三聚体，分子量为156 207kD之间，其沉降系数一般 在6s左右。在机体体液免疫系统对腺病毒感染产生的应答反应中，主要针对病毒的3种主要抗原成 分产生抗体，这3种抗体在血清中出现的时相是不一致的，依次为抗纤维蛋白抗体 (anti-Fi)、抗五邻体抗体(anti-Pb)以及抗六邻体抗体(anti-Hx)。目前抗病毒感染常用的药物， 一般为化学合成药，中草药，以及十扰素等生物制剂，在 这些药物中尚无一种针对病毒且疗效肯定的药物。抗病毒免疫球蛋白是由病毒感染后或者是 利用病毒的蛋白质、多糖、核酸、活载体、感染因子等诱导，在体内产生的主要特异性的 抗病毒物质。由于腺病毒的广泛流行，就会有一部分人是由隐性感染而获得抗病毒能力而产 生高效价的抗腺病毒特异性免疫球蛋白。从血源中筛选高效价抗腺病毒免疫球蛋白，可获得 广泛供血来源，能有效满足临床的需要。而利用病毒的蛋白质、多糖、核酸、活载体、感染 因子等诱导动物或人的免疫系统产生针对腺病毒的保护性抗体，通过筛选，采集具有高效价 腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的动物或人的体液或血液，通过分离提纯以及灭活可 能存在病毒制得特异性的抗腺病毒免疫球蛋白。 三、
技术实现思路
本专利技术目的在于，提出一种抗腺病毒特异性免疫球蛋白的高效价的人的体液或血液的制备方法、筛选方法以及特异性免疫球蛋白的制备方法。本专利技术的技术思路是，腺病毒是小儿病毒性肺炎常见的病原体，病毒通过呼吸道传染， 有明显的季节性，以冬、春为主，约80%的腺病毒肺炎发生在6个月至2岁的小儿，年长儿 病情较轻，或仅表现为上呼吸道感染的症状，但重症患儿的病死率高达33. 6%。根据病毒感 染后，腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白作为抗原刺激成熟B细胞活化、增殖， 在T细胞的辅助下变成将细胞并分泌Ig,经过一段时间后，当机体再次受到腺病毒感染，受 到腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白刺激后，机体很快产生抗体，而且抗体效价 很高，持续时间在l个月以上，下降速度也很慢。正常人群都曾一次或多次感染过ADV， 并普遍存在ADV隐性感染，所以有一部分人群体内具有高效价腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和 anti-Hx抗体存在。采用从腺病毒中提取的含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋 白的病毒碎片作为抗原，建立ELISA方法在健康献血源中筛选高效价抗腺病毒的免疫球蛋 白，经肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等血源性传染病检验合格后，用低温乙醇方法提取免疫球 蛋白，制备成含有高效价腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白制剂。本专利技术所采用的技术方案是，高效价腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋 白制备方法，其特征在于，包括以下步骤1) 制备含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的抗原 将腺病毒接种于己成长单层的H印-2细胞或hela细胞或人胚肾细胞或KB细胞或人胚肺二倍体细胞或Vero细胞，在培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变(CPE) 出现+++ (即细胞病变约占整个单层细胞75%)，收集细胞及上清，病毒灭活，在-7(TC反复 冻融，再经超声打碎、冰冻保存；2) 纯化病毒抗原用氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖作为介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通 过重力或离心力场的作用使病毒碎片分层、分离，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；将超声 打碎的腺病毒培养液高速离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以5%、 15%、 30%、 45%、 60% 的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心2小时，根据病毒的分子量确定本文档来自技高网...
【技术保护点】
腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：１）制备含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的抗原将腺病毒接种于已成长单层的Ｈｅｐ－２细胞或ｈｅｌａ细胞或人胚肾细胞 或ＫＢ细胞或人胚肺二倍体细胞或Ｖｅｒｏ细胞，在培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变（ＣＰＥ）出现＋＋＋（即细胞病变约占整个单层细胞７５％），收集细胞及上清，病毒灭活，在－７０℃反复冻融，再经超声打碎、冰冻保存；２）纯化病 毒抗原用氯化铯或蔗糖或多聚蔗糖作为介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用使病毒碎片分层、分离，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；将超声打碎的腺病毒培养液高速离心２０分钟，弃去沉渣留上清，装入以５％、１５％、 ３０％、４５％、６０％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心２小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存；３）建立筛选高效价腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白方法用从腺病毒 中提取的含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白病毒碎片混合作为抗原，以１０μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ包被酶板，利用结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，来自人或动物的血浆、血清和体液中腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白抗体与固相载体表面的腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白起反应，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析，由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度；４）用上述方法筛选的产物用硫酸铵沉淀法 或聚乙二醇沉淀法或低温乙醇方法或／和离子交换层析法方法或／和亲和层析法提取高效价腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白；５）提纯后的腺病毒ａｎｔｉ－Ｆｉ、ａｎｔｉ－Ｐｂ和ａｎｔｉ－Ｈｘ的免疫球蛋白经６０±１ ℃，１０小时灭活病毒和／或在ｐＨ值４．１±０．３，在２４±１℃条件下放置２１天和／或纳米膜过滤和／或溶剂／表面活性剂（Ｓ／Ｄ）...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余军，
申请(专利权)人：同路生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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