含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因及其编码的蛋白和应用制造技术

本发明专利技术提供一类含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子，由可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因经重组而形成，并在可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因之间插入了编码ｆｕｒｉｎ蛋白酶识别位点的基因序列。这类靶向重组分子基因表达产物的单链抗体部分可以特异性识别、结合表达有特定抗原的靶细胞，并介导重组蛋白内化进入靶细胞内吞体；重组蛋白在内吞体中经ｆｕｒｉｎ蛋白酶切割后单链抗体与其他部分分离，暴露出流感病毒血凝素融合肽，并在其作用下通过破坏内吞体膜稳定性将促凋亡分子释放入胞浆；最终促凋亡分子在胞浆中高效诱导靶细胞凋亡，发挥其生物学活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建由可内化的单 链抗体、流感病毒血凝素融合肽和促凋亡分子组成的靶向重组分子基因、上述基因编码的 蛋白及所述的基因和蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
技术介绍
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物。 由于其特异性高、性质均一、可针对特定靶点向制备，抗体药物已被广泛应用于感染、心血 管疾患、自身免疫疾患等多种疾病治疗，特别是在肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。抗 体药物具有如下特点(1)特异性。抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这 是抗体药物发挥靶向治疗作用的重要基础；(2)多样性。主要表现为靶抗原的多样性、抗体 结构的多样性和作用机制的多样性以及“弹头”效应分子的多样性；(3)制备抗体药物的定 靶性。即根据需要，制备具有不同治疗作用的抗体药物。可以针对特定的靶分子，定向制备 相应的抗体，实行“量体裁衣”；也可以根据需要选择相应的“弹头”药物或“效应分子”，制 备相应的免疫偶联物或融合蛋白。抗体融合蛋白是抗体介导的靶向重组分子，由抗体片段(如单链抗体)和效应蛋 白两个基本部分构成。抗体片段可以将效应蛋白携带至靶细胞表面，其后效应蛋白发挥其 特定的生物学活性。与单一的单克隆抗体药物主要通过封闭特定信号通路发挥作用相比， 抗体融合蛋白兼具抗体的靶向性和效应蛋白的高生物活性，具有更有效的结构优势。然而， 大多数效应蛋白发挥作用的场所是细胞浆，虽然可内化的单链抗体可以通过靶细胞的内化 作用介导效应蛋白进入靶细胞内吞体，但是由于效应蛋白不能自由穿透内吞体膜结构进入 胞浆，抗体融合蛋白的功效被大大降低。因此，对传统抗体融合蛋白进行结构改造，提高效 应蛋白转位进入胞浆的能力是抗体靶向治疗亟待解决的关键问题之一。流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒包膜表面的一种主要膜蛋白， 由病毒基因组片段4编码，可诱导感染机体产生保护性中和抗体。HA分子感染细胞前必须 经酶裂解成HA1和HA2, HA1具有与宿主细胞受体结合的特性，HA2参与病毒和细胞融合的过 程。流感病毒血凝素融合肽(hemagglutinin fusion peptide)由流感病毒HA2亚单位 N端的20个氨基酸残基组成，能介导病毒外膜与细胞内小体膜融合并释放病毒核衣壳进入 胞浆。流感病毒的融合肽的膜融合作用具有PH依赖性。在较高PH环境下，融合肽N端α 螺旋插入内吞体膜结构中，而C端的空间构象松散，溶于水相中。在质子泵作用下，内吞体 内PH逐渐下降。当ρΗ降至5.0左右时，HA Glu11和Glu15所带电荷被中和，C端极性降低， 在Trp14和Ile18之间形成新的螺旋结构并插入到内吞体膜结构中，与N端α螺旋形成“倒 V”字形结构。融合肽空间构象的变化引起内吞体膜结构稳定性的变化，最终导致膜融合和 内吞体内物质“外泻”进入细胞液(Vaccaro L,Cross K J,Kleinjung J，et al. Plasticityof influenza haemagglutinin fusionpeptides and their interaction with lipid bilayers. Biophys J, 2005,88(1) :25_36)。流感病毒血凝素融合肽能破坏内吞体膜结构稳 定性，这为向细胞液内导入外源蛋白提供了有力的工具
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建一类特异性强、活性高的靶向重组分子，这类靶向重组分 子可用于肿瘤、感染性疾病等的靶向生物治疗。本专利技术为实现上述专利技术目的，将能特异性识别并结合肿瘤抗原(如HER2)或其他 疾病特异性抗原(如乙肝表面抗原HBsAg)的可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合 肽(HAfp)基因和促凋亡分子基因(如活性杀伤分子bid)融合，并在可内化单链抗体基因 与HAfp基因之间加入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。这样，经基因重组获得的 重组分子同时具有抗体对靶细胞的特异性识别功能、HAfp破坏靶细胞内吞体膜稳定性功能 和促凋亡分子诱导靶细胞凋亡的生物学功能，可以用于肿瘤等疾病的靶向治疗。本专利技术的技术解决方案是含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，由 可内化单链抗体基因、流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因组成，并在可内化单 链抗体基因与HAfp基因之间加入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。由上述的基因编码的蛋白，由可内化单链抗体、流感病毒血凝素融合肽和促凋亡 分子组成，并在可内化单链抗体与HAfp之间加入了编码furin蛋白酶识别位点氨基酸序 列。所述的基因在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。所述的蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本专利技术所构建的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子具有以下特点①特 异性——靴向重组分子通过单链抗体特异性地识别表达有特定肿瘤抗原的肿瘤细胞，而对 正常组织细胞没有识别和杀伤作用；②安全性——靴向重组分子主要由人源化单链抗体和 人自身促凋亡分子构成，而流感病毒血凝素融合肽序列短、免疫原性小，反复使用不会诱发 体内产生中和抗体，而且细胞发生凋亡时不引起炎症反应，所以治疗的毒副作用较小；③高 效性——重组分子负载的促凋亡分子具有高效的促细胞凋亡生物活性。如具有杀伤活性的 Bid是细胞凋亡通路中重要的信号传导分子，向细胞中导入活性形式的截短型Bid(tbid) 分子，不仅能够激活caspases通路的凋亡效应，还可以促进AIF等不依赖caspases的凋亡 诱导分子从线粒体中释放，即使caspases被抑制也能启动凋亡的发生，使其对肿瘤细胞的 杀伤作用更直接，且效率更高。此外，靶向重组分子结合靶细胞并内化进入内吞体后，在内 吞体furin蛋白酶的作用下被剪切，释放出Hafp-促凋亡分子小片段，并在HAfp的作用下 实现了促凋亡分子高效转位至胞浆从而发挥其促凋亡生物活性。本专利技术的研究结果表明，含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子能够特异性 识靶细胞并被靶细胞内吞进入内吞体；由于HAfp的存在，活性促凋亡分子能从内吞体中高 效转位至胞浆；促凋亡分子在靶细胞内可充分发挥其促细胞凋亡的生物活性。本专利技术可望为肿瘤等多种疾病的靶向生物治疗提供一种新手段。附图说明图1为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。图2为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因原核表达产物Westen blot鉴定结果图。图3为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子抗原结合活性ELISA鉴定结果图。图4为HBsAg靶向促凋亡分子特异性识别靶细胞的间接免疫荧光结果图。图5为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子抑制靶细胞的生长的MTT结果图。图6为HBsAg靶向促凋亡分子杀伤HBsAg阳性肿瘤细胞的流式细胞检测结果图。具体实施例方式本专利技术构建的靶向重组分子由可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基 因和促凋亡分子基因经重组而形成，并在可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基 因之间插入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。现以乙肝病毒表面抗原HBsAg和肿 瘤特异性抗原HER2为例，构建HBsAg/HER2靶向促凋亡分子，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，由可内化的单链抗体基因、流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因重组而成，并在单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因之间加入了编码ｆｕｒｉｎ蛋白酶识别位点的基因序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安钢，王涛，闫博，温伟红，贾林涛，王芳，白文栋，赵晶，陈锐，赵智凝，任君琳，孟艳玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[]