本发明专利技术提供一种甲型流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)及其基因和制备方法，以及流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选模型的构建方法。尤其用毕赤酵母分泌表达甲型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶，获得了具有生物活性的神经氨酸酶，特别的是去除了NA全长序列N端的82个氨基酸的截短神经氨酸酶，避免了繁琐耗时且存在安全问题的由全病毒制备NA的操作过程。本发明专利技术还利用该酶构建甲型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶抑制剂筛选模型，具有药物作用机制明确、材料用量少、筛选速度快、灵敏度高、可实现高通量筛选等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗流感病毒药物筛选领域，具体涉及一种流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶及其基因并利用该酶构建其抑制剂筛选模型及应用。
技术介绍
流感病毒长期以来一直严重威胁着人类的健康，近年来其H5m和Hmi亚型的相继暴发加大了全世界对抗流感病毒药物的需求。目前FDA许可的治疗流感的药物主要有四种金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、奥司他韦(Oseltamivir)和扎那米韦(Zanamivir)。随着耐药病例的不断增加，人类正面临着流感病毒大规模爆发的严峻考验，新型抗流感病毒药物的研发势在必行，这使得设计合成或从化合物库中筛选新型神经氨酸酶抑制剂成为当前研究的热点和难点。在创制新药的研究中，寻找和发现具有生物活性的先导化合物是至关重要的环节之一，而对大量化合物进行活性筛选则是发现先导化合物的主要手段和途径。在目前流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase，·)抑制剂的多种筛选模型中，神经氨酸酶主要由全病毒制备，制备过程比较繁琐耗时，并存在安全问题。分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点，已经成为目前药物筛选的主要方法。到目前为止，国内外尚无利用毕赤酵母表达的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶构建的模型大规模筛选抗流感病毒药物得报道。异源表达是获得靶点蛋白的一个有效途径，相对于哺乳动物和昆虫细胞表达系统，毕赤酵母表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低；具有aox强启动子，外源蛋白受甲醇严格诱导调控而表达；具有后修饰能力，可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的流感病毒Hmi亚型神经氨酸酶抑制剂筛选模型中使用的神经氨酸酶制备繁琐耗时，并存在安全问题的不足，而提供一种甲型流感病毒神经氨酸酶及其基因和制备方法，以及流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选模型的构建方法。本专利技术的第一方面是提供一种甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因，其核苷酸序列是以下任何的一种1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本专利技术中，SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的神经氨酸酶基因的核酸序列全长1407bp，编码469个氨基酸，所用密码子有利于NA基因在毕赤酵母中表达。本专利技术中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白为去除了全长NA蛋白N端的82个氨基酸，是截短NA。本专利技术的第二方面是提供含有如上所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因的重组载体。所述的重组载体的所用的载体是本领域的常规载体，优选载体PPICZ α A。本专利技术的第三方面是提供含有如上所述的重组载体的转化子。所述的转化子的宿主细胞是本领域常规的宿主细胞，优选毕赤酵母，更优选毕赤酵母ΚΜ71或者SMDl 168表达菌株。本专利技术的第四方面是提供一种重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。其为去除了 NA全长基因N端的82个氨基酸，是截短ΝΑ，具有神经氨酸酶生物活性。本专利技术的第五方面是提供一种制备分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌的方法，包括以下步骤1)合成经密码子优化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因；2)将神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即得表达神经氨酸酶的基因工程菌。本专利技术中，步骤1)所述的神经氨酸酶基因的合成方法可以常规方法，可以人工合成全长基因。步骤幻所述的神经氨酸酶基因可以是步骤1)合成的经密码子优化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因，也可以以序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因为模板，利用引物扩增扩增获得截短的仅含有功能区域，去除了可能与催化活性无关区域的神经氨酸酶基因，较佳的是利用引物扩增获得编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神经氨酸酶基因；所述的利用引物扩增获得截短的神经氨酸酶基因的方法是本领域的常规方法，以步骤1)所合成的神经氨酸酶基因为模板扩增得到编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神经氨酸酶基因。所述的引物较佳的是上游引物NA_F的序列为5，-GCCTCGAGAAAAGAGTTAAGTTGGCTGG-3，(如序列表中 SEQ ID No. 3 所示)，下游引物 NA_R 的序列为 5 ’ -GCTCTAGACCCTTGTCAATGGTGAATGG-3 ’(如序列表中SEQ ID似.4所示)，分别具有》!01和)0^1酶切位点。所述的酵母表达载体较佳的是质粒PPICZ α Α。所述的毕赤酵母表达菌株较佳的是毕赤酵母KM71或者SMD1168。KM71或者SMD1168两种重组子表达的截短NA分泌至胞外时均经Kex2切割而具有天然的N端序列，无额外增加的氨基酸。所述的将截短的神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体的克隆方法是本领域常规方法。较佳的，如上利用引物NA_F和NA_R扩增获得截短NA基因，通过BioI和^CbaI酶切位点构建含有截短NA基因的重组载体pPICZ α A-NAS,然后用电转化法将McI酶切线性化的pPICZ α A-NAS导入毕赤酵母中，利用kocin 抗性筛选重组菌株，最后诱导重组毕赤酵母分泌表达截短NA。本专利技术的第六方面是提供如上所述的方法制备得到的分泌表达甲型流感病毒HlNl亚型的神经氨酸酶的基因工程菌。本专利技术的第七方面是提供如上所述的重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶在神经氨酸酶抑制剂筛选模型中的应用。本专利技术的第八方面是提供一种神经氨酸酶抑制剂筛选模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤将所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即获得分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌，培养后得到具有生物活性的神经氨酸酶，在反应体系中加入该截短神经氨酸酶、底物4-MUNANA和待筛选的抑制剂，温育后在360nm的激发光和460nm的发射光下检测荧光强度的变化。其中，获得分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌的较佳方法如上文所述，即所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因的核苷酸序列是以下任何的一种1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，幻编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列；所述的毕赤酵母优选毕赤酵母KM71或者 SMD1168 表达菌株。而化合物 4-MUNANAG-methylumbelliferyl-N-acetyl- α -D_neuralminic acid)是神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物4-MU(4-methylumbelliferone)被360nm照射光激发可以产生460nm荧光，荧光强度的变化可以灵敏地反应神经本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱宝泉，林军，胡海峰，胡又佳，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：
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