存在对在生物样品、特别是人的体液临床样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ的改进的比浊免疫测定法的需要。本发明专利技术提供能够通过比浊法测量人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ的比浊免疫测定方法和试剂组，其导致令人惊讶地比当前现有技术更强和更快的比浊信号。所述提高的和更快的信号是通过使用新的试剂和组合物而获得，并且能够获得更短的测定时间和具有更强的信号的动力学读数，提高了整体测定速率和质量。本发明专利技术实现了针对脂质干扰的提高的稳定性和提高的线性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的比浊免疫测定本专利技术涉及通过利用特异性的纳米颗粒(nanoparticle)-抗体偶联物评 估在人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的改进的比浊免疫测定； 通过利用所述测定评估患者的肾小球滤过率的方法；相应的反应试剂盒； 和改进的纳米颗粒-抗体偶联物对上述提及的医学目的的应用。
技术介绍
A. Grubb和H. Lovberg [Grubb AO，等尸rac. A^/. ^cad t/5L4 (美 国国家科学院学报)1982;79]于1981年发现并且表征了抑半胱氨酸蛋白酶 蛋白C。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C是在后来命名为抑半胱氨酸蛋白酶蛋白 蛋白超家族中发现的第一个蛋白。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白蛋白超家族是一 组抑制半胱氨酸蛋白酶的蛋白。目前抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的其它生物 学功能正在研究中。与抑半胱氨酸蛋白酶蛋白超家族的其它成员相反，抑 半胱氨酸蛋白酶蛋白C存在于所有的体液中，而不同的抑半胱氨酸蛋白酶 蛋白的总组成随体液与体液而不同，并且在不同的区室中[AbrahamsonM， 等《/ S/o/. (生物的化学杂志)1986;261:11282]。在1990年，Abmhamsson等证明抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C以稳定的速率并且由人体中 全部(或接近全部)有核细胞产生，其叫作持家蛋白[AbrahamsonM，等: 5/oc/zem.J (生物化学杂志)1990;268:287-94]。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C---具有13kD的分子量----自由滤过肾脏的 正常的肾小球膜，但是然后在近端小管中重吸收并且分解代谢，所述近 端小管是重吸收通过肾小球膜的大部分肽和小蛋白的肾脏的区室。以这 种方式，肾脏为机体保存这些蛋白质物质，并且阻止损失到尿中(Jacobsson B,等7/^opaAo/ogy(组织病理学)1995;26:559-64.)[HeymsSB，等^m. / C7/. A^r.(美国临床营养学杂志)1983; 37: 478]。肌酸酐，迄今为止关于肾小球滤过率(GFR)的主要应用的标记，是在 肌肉细胞中产生的小分子量分子。因此，肌酸酐的形成和分泌的速率与机体的肌肉质量紧密联系。公知地，群体中个体的肌肉质量变化相当大。与 机体质量相比，老年人通常具有低的肌肉质量，而且随着他们的疾病发展 许多患者失去肌肉质量。与成年人相比，儿童通常具有不同的相对肌肉质 量，并且男人比女人具有平均更高的相对肌肉质量。因此，当将血清肌酸 酐浓度用作肾小球滤过率标记时，可以发现血清肌酸酐值在参照范围内，即使在已经发生50。/。的肾小球滤过率减少时[Shemesh O,等(肾 脏内科)1985;28:830-8]。此外日常饮食显著地影响肌酸酐的血清水平， 特别是富含蛋白质的饮食[PerroneRD，等C7z'. Cfew.(临床化学)1992; 38: 1933-53〗。血清和血浆肌酸酐测量不是测量肾小球滤过率的可靠的黄金标准方 法。因此，使用静脉内注射放射性标记物质如Cr-51-EDTA或 Tc-99m-DTPA，或者注射碘化剂如碘海醇，已经获得一些流行。这些方法 是昂贵的、耗时的，并且注射是必需的…-并且通常重复地采样血液。在 Grubb等在Clinical Chemistry (临床化学)51:8， 1420-1431中的Simple Cystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration Rate Compared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equation for Adults and the Scwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations for Children (单纯基于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的肾小球滤过率预测方程与 用于成年人的肾病预测方程和用于儿童的Scwartz和Counahan-Barratt预 测方程中的饮食改进的比较)的出版物中，证明血液中的单纯抑半胱氨 酸蛋白酶蛋白C测量可以替代测量肾小球滤过率的复杂方法。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测量最初使用经典的生物化学方法，但是不 久转向应用比浊和浊度免疫测定。埃德-白令公司(Dade-Behring Company) 开创了比浊法测量方法。还参见Coll,E等.Am. J. Kidney Disease (美国肾 病杂志)2000; 36, 2934。比浊法是非常可靠的。比浊法的缺点在于，与基 于光透射的自动分光光度计相比，仪器本身具有相当低的处理速度。由埃 德-白令公司(Dade-Behring Company)生产的比浊计，典型地BNII比浊 计和ProSpec比浊计，以及Beckman仪器，已经获得了大量的市场畅销度， 但是广泛性比基于透射测量的仪器低得多。比浊计还具有比基于透射测量 的大型自动化仪器低得多的样品通量。H. Stone 等在文献Analytical performance of a particle-enhanced nephelometric immunoassay for serum Cystatin C using rate analysis (j吏用速 率分析的血清抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的颗粒-增强的比浊计免疫测定的 分析性能)，Clinical Chemistry (临床化学)巻8,第1482-85页，2001 ， 描述了速率比浊方法。然而，比浊计仪器具有对于大量样品的有限的容量， 并且比浊计仪器的数目是有限的。因此，存在转向吸光度分光光度计-均相 的仪器的需要，原因在于这样的仪器更丰富，并且具有更高的容量。丹麦Dako Cytomation己经开创了比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫 测定的领域。现有技术在下列文献中描述Cystatin C - The marker of choice for renal flmction testing (抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C-肾功能检测选 择的标记)，C. Schmidt, European Clinical Laboratory (欧洲临床实验室)， 2004年2月10日；New improved automated particle enhanced turbidimetric immunoassay for quantitative determination of human Cystatin C in serum and plasma (定量确定血清和血浆中人抑半胱氮酸蛋白酶蛋白C的新改进的自 动化颗粒增强的比浊免疫测定)，C. Schmidt, C. Kj0ller和K Grankjaer， 2005年7月从Dako Cytomation AS网址下载的介绍(通过引用结合)。然而，比浊测量受到样品中浊度的干扰，如在文献Turbidity in immunoturbidimetric assays(免疫浊度法测定中的浊度)，，，Dahr等，Ann. Clin. Biochem.(临床生物化学年刊)巻27,第509页，199本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于评估人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ的比浊免疫测定方法，其通过下列步骤进行： ａ）通过将所述样品与包含适合于比浊测量的纳米颗粒的纳米颗粒－抗体偶联物接触而形成测定混合物，其中所述纳米颗粒用抗－人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ抗体或其 抗原结合片段包被，以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ，其中所述包被的纳米颗粒具有至少４０ｎｍ范围内的中数直径，和 ｂ）通过确定在３４０ｎｍ以上和５００ｎｍ以下的范围内的至少一个波长处的吸光度变化，测量所述混合物的浊度的变化而评估所述人抑 半胱氨酸蛋白酶蛋白Ｃ的含量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-5-21 07010086.21.用于评估人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法，其通过下列步骤进行a)通过将所述样品与包含适合于比浊测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体偶联物接触而形成测定混合物，其中所述纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被，以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其中所述包被的纳米颗粒具有至少40nm范围内的中数直径，和b)通过确定在340nm以上和500nm以下的范围内的至少一个波长处的吸光度变化，测量所述混合物的浊度的变化而评估所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量。2. 权利要求1的方法，其中确定初始吸光度变化速率。3. 权利要求1或2的方法，其中在形成所述测定混合物后立即或不久 后开始的至少一个约5-300秒的时间间隔内确定所述初始吸光度变化速 率。4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述抗体是针对人抑半胱氨酸 蛋白酶蛋白C的多克隆非人、非啮齿动物抗体。5. 权利要求4的方法，其中所述多克隆抗体是针对人抑半胱氨酸蛋白 酶蛋白C的禽类抗体。6. 权利要求4和5中任一项的方法，其中至少25重量％的所述多克 隆抗体或片段通过使用人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的亲和纯化而获得。7. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述抗体包括(a)结合人抑 半胱氨酸蛋白酶蛋白C的单一表位的单克隆抗体，或(b) —组两种或多种 种类的单克隆抗体，其中每种种类的单克隆抗体结合人抑半胱氨酸蛋白酶 蛋白C的不同的表位，或者两种或多种种类以不同的结合强度而结合相同 的表位。8. 权利要求7的方法，其中所述单克隆抗体是非人来源的。9. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述包被的纳米颗粒具有大于 58nm的平均直径。10. 权利要求9的方法，其中所述包被的纳米颗粒具有80-105 nm范围内的平均直径。11. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述包被的纳米颗粒用约5-35%的结合抗体/所述纳米颗粒-抗体偶联物的总重而包被。12. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述包被的纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c抗体和至少一种惰性蛋白质的混合物包被。13. 前述权利要求中任一项的方法，所述纳米颗粒基本上由聚苯乙烯、 聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏l,l-二氯乙烯、聚-a-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙 烯萘、以及它们相应的共聚物制成。14. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述浊度变化通过在350-499 nm范围内的至少一个波长处和在1...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤姆尼尔森，
申请(专利权)人：根田股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]
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