需要用于生物样品，特别是人的体液临床样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的改进的浊度测定法免疫测定。本发明专利技术提供能够通过浊度测定方法测量人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的浊度测定免疫测定方法和试剂组，其令人惊讶地导致比现有状态的技术更强和更快的浊度测定信号。提高的和更快的信号通过使用新的试剂和组合物而获得，并且能够获得更短的测定时间和具有更强的信号的动力学读数，提高了整体测定速率和质量。本发明专利技术实现了针对脂质干扰的提高的稳定性和提高的线性。Ｓ
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及这样的纳米颗粒-抗体缀合物在评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中或者在评估哺乳动物的肾小球滤过率的诊断方法中的应用。 最后，本专利技术涉及这样的纳米颗粒-抗体缀合物在评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中或者在评估肾功能障碍如肾不足或衰竭的诊断方法中的应用。 b)抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的制备 b1)多克隆抗体 多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体可以通过本领域公知的方法制备，诸如例如由Chase，M.W.，1967，.在″Methods of Immunology andImmunochemistry(免疫学和免疫化学方法)″中，Williams，A.等编，M.W.，第197-209页，学院出版社(Academic Press)，纽约中所述的那些。简言之，将适当物种的动物(例如，兔、山羊、或绵羊、或者，优选地禽类物种，特别是家禽，如母鸡)用在适当的佐剂如弗氏完全或不完全佐剂中的纯化的抗原重复免疫。在免疫后，将动物采血，并且通过诸如例如硫酸铵或氯化铵沉淀、阴离子交换层析、免疫亲和层析和/或亲和层析的方法纯化多克隆抗体。 为了获得充分的浊度测定信号，优选高抗体亲抗原性的抗体。由于多克隆抗体包括许多不同的抗体分子，所以不能计算亲和力常数，然而，通过常规的多克隆抗体技术获得高的抗体亲抗原性和亲和力。使用通过常规方法获得的兔抗体，然而，使用绵羊抗体获得甚至更好的结果。当使用禽类抗体时，获得甚至更好的结果。禽类抗体可以按照在Larsson A，BaaloewR-M，Lindahl T，和Forsberg P-O在Poultry Science(家禽科学)721807-1812，1993中所述的方法。考虑到在遗传上与人更不同的禽类能够产生具有比多克隆哺乳动物抗体更高的抗体亲抗原性的针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的抗体。 多克隆禽类抗体通常从蛋黄中获得(并且因此指定为IgYs)。然而，蛋黄含有大量的脂质，使得它们的进一步应用成问题。IgY可以通过使用逐步硫酸铵(例如25-40％)和聚乙二醇(PEG)沉淀而从蛋黄中分离。对于初始纯化，还可以参考供应商的用法说明而应用也是商业的可从GallusImmunotch Inc，Cary，美国获得的IgY纯化试剂盒，或从Pierce，Rockford，美国获得的鸡EggcellentIgY纯化试剂盒。 此外，多克隆抗体的抗体亲抗原性可以通过使用利用抗原亲和纯化方法，如按照从www.piercenet.com(2006年4月)下载并且通过引用结合的“Affinity Purification of Proteins(蛋白质的亲和纯化)”中的教导，而纯化的抗体而进一步提高。在下文进一步描述亲和纯化。 当所用的抗体中有20％是抗原亲和纯化的时，特别观察到提高的抗体亲抗原性，当所述抗体中有50％是抗原亲和纯化的时，观察到甚至有更高的提高，并且当所述抗体中有大于75％，如75-100％是通过抗原亲和纯化方法获得的时，甚至提高更高。 对于禽类多克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的亲和纯化，已经制备了适当的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C亲和柱。通过标准方法将纯化的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C固定在适当的固体支持物上，例如琼脂糖或亲和凝胶，其是活化的以将所述抗原共价连接到支持物上(例如，适当的活化的固体支持物可从Pierce，Rockford，美国获得)。然后，由所述携带抗原的树脂而制备亲和柱。 抗体的成功的亲和纯化取决于所述抗原上的相关表位向所述抗体的结合位点的有效呈递。如果所述抗原是小的，并且通过多个化学键直接固定在固体支持物表面上，那么重要的表位可能被封闭或者空间位阻，而抑制有效的抗体结合。因此，最好使用独特的官能团(例如，在肽的单个末端半胱氨酸上的巯基)而固定抗原，并且最好使用其反应基团存在于几个原子长的间隔臂上的活化的支持物。对于更大的抗原，特别是具有多个固定位点的那些抗原，由于所述抗原本身作为支持基质和表位之间的有效的间隔，所以所述间隔臂长度不那么重要。 由于每种方法的核心是对于其各自的抗原的抗体的亲和力，所以在抗体的亲和纯化的典型的结合和洗脱条件之间通常存在很少的变化。由于抗体设计成在生理条件下识别并且紧密结合抗原，所以大部分的亲和纯化方法使用模拟生理pH和离子强度的结合条件。最常见的结合缓冲液是在pH7.2的磷酸缓冲盐(PBS)和Tris缓冲盐(TBS)以及1.5M NaCl(例如，预先混合的缓冲液包装可从Pierce，Rockford，美国获得)。一旦所述抗体已经结合到固体的抗原上，其余的结合缓冲液用来洗涤支持物的未结合的物质。为了将非特异性结合最小化，所述洗涤缓冲液可以包含其它的盐或去污剂，以破坏任何弱的相互作用。 特别地，通过改变缓冲液(例如，常见的洗脱缓冲液可从Pierce，Rockford，美国获得)的pH和/或离子强度而将纯化的抗体从亲和树脂上洗脱下来。抗体通常是耐受pH 2.5-11.5范围的弹性蛋白，具有最小的抗体亲抗原性损失，并且迄今为止，这是最常见的洗脱策略。在一些情形中，抗体-抗原的相互作用没有被pH变化有效破坏或者被pH损坏，这需要应用备选策略。 下面给出亲和纯化方法的实例 步骤1在每次使用之前，用10个柱体积的下述顺序的缓冲液洗涤柱(～1ml树脂床)，以去除残留的蛋白质 0.2M甘氨酸，pH 2.8～10ml 0.1M NaHCO3，pH 8.5，0.5M NaCl～10ml 使用上述缓冲液重复循环两次。然后将所述柱在含有被调整到0.5M的NaCl的TTBS缓冲液(0.3M NaCl，20mM Tris/Cl，pH 7.8，0.1％(v/v)吐温-20和0.01％NaN3)中平衡。 步骤2向10ml等分试样的粗抗体制备物中，加入1ml 10X TTBS和0.55ml 4M NaCl。将混合物离心以去除任何沉淀。 步骤3通过将所述亲和树脂转移到含有血清的管(15ml管)中，而分批吸收所述抗体。在冷室中温育。备选地，人们可以使用低流速将血清施加到柱上。获得人工收集的级分。收集流过柱的相(phase)，并且使用低流速将其第二次重新施加。 步骤4用TTBS+NaCl至0.5M充分洗涤柱，直到A280小于0.02。收集10ml洗涤的级分，并且检验所述级分的A280。 步骤5使用含有0.02％NaN3的0.2M甘氨酸，pH 2.8洗脱抗体。使用1ml等分试样的缓冲液进行洗脱。将级分收集到含有50ml 1M Tris，pH8.5的1.5ml微量离心管中。这在蛋白洗脱下来之后立即中和酸性的洗脱缓冲液。收集至少10个级分。这通常足以去除所述抗体。使用适当的空白(即，1ml甘氨酸缓冲液加50ml 1M Tris)，读取每个级分的A280。 步骤6将适当的级分合并。获得合并物的A280，并且将抗体保存在4℃，或者考虑在存在50％甘油时以等分试样冷冻(-70℃)。 步骤7通过用0.2M甘氨酸，pH 2.8缓冲液，而后用TTBS充分洗涤而洗涤柱。 b2)单克隆抗体 在颗粒-增强的浊度测定中，多克隆抗体通常比单克隆抗体更优选。多克隆抗体固有地与抗原(或分析物)上的许多不同的表位反应(与单克隆抗体相反)，并且因此，更容易本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于评估人体液样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的浊度测定法免疫测定，其通过下列步骤进行： ａ）通过将所述样品与包含适用于浊度测定法测量的纳米颗粒的纳米颗粒－抗体缀合物接触而形成测定混合物，其中所述纳米颗粒用抗－人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ抗体或其抗原结合片段包被，以结合所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ，其中所述包被的纳米颗粒具有至少４０ｎｍ范围内的中值直径，并且 ｂ）通过测量所述混合物的浊度的变化而评估所述人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的含量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：卡特林森德，汤姆尼尔森，
申请(专利权)人：根田股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]
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