改进的钙卫蛋白测定法制造技术

样品中钙卫蛋白的浓度可使用颗粒增强比浊免疫测定法以改进的准确度确定，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其中校准物缓冲液和/或反应缓冲液的选择由样品的特性决定。

Improved determination of calprotectin

The concentration of calprotectin in the sample can be determined with improved accuracy by particle enhanced turbidimetric immunoassay, which includes anti calprotectin antibody or its fragment immobilized to the particle, reaction buffer and calibrator containing calprotectin in the buffer, wherein the selection of calibrator buffer and / or reaction buffer is determined by the characteristics of the sample.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的钙卫蛋白测定法
本公开涉及诊断测定法领域，并且具体地涉及用于确定样品中钙卫蛋白浓度的改进的测定方法和试剂盒。
技术介绍
钙卫蛋白为哺乳动物蛋白S100A8和哺乳动物蛋白S100A9的复合物，属于S100家族。钙卫蛋白在中性粒细胞和单核细胞中表达。在钙的存在下，钙卫蛋白复合物能够经由螯合作用螯合必需营养素锰和锌。因此，钙卫蛋白表现出抗微生物特性，并且被认为是先天宿主防御机制的重要部分。据说钙卫蛋白以二聚体、三聚体和四聚体形式存在。作为二聚体，钙卫蛋白包含多肽链S100A8和S100A9。人S100A8由93个氨基酸残基组成，并且分子量为10.8kDa。S100A9含有113个氨基酸残基，并且分子量为13.2kDa。因此，在二聚体形式中，钙卫蛋白的分子量为24kDa。作为三聚体，钙卫蛋白为一种36kDa异三聚体蛋白，具有非共价连接的两条重链(13.2kDa)和一条轻链(10.8kDa)。作为四聚体，钙卫蛋白为一种48kDa异三聚体蛋白，具有非共价连接的两条重链(13.2kDa)和两条轻链(10.8kDa)。此外，存在S100A9的截短同种型，这是由于另一种翻译致使N末端中4个第一残基的丢失(《美国质谱学会杂志(JAmSocMassSpectrom.)》1999年11月；10(11):1124-30。)它的分子量为12.7kDa。截短形式结合到二聚体形式中致使形成分子量为23.5kDa的稍小的复合物。钙卫蛋白可能的同种型的示例列于表1中：表1.钙卫蛋白同种型的分子量区间同种型分子量单体10.8kDa至13.2kDa同二聚体21.6kDa至26.4kDa异二聚体23.5kDa至25.9kDa三聚体32.4kDa至39.6kDa四聚体43.2kDa至52.8kDa钙卫蛋白已被用作中性粒细胞活化的标志物，并且已被证明在涉及中性粒细胞活化的炎症性条件下升高。在血液和粪便中检测到钙卫蛋白水平升高，并且钙卫蛋白的存在被认为是炎症的重要标志物。2016年发表了一篇综合评论；M.Pruenster等人S100A8/A9：“从基础科学到临床应用(Frombasicsciencetoclinicalapplication)”《药理学(Pharmacology)》.2016年8月1日，第167卷，第120页至第131页。似乎血浆S100A8/A9水平可用作大量炎症性病症中的炎症的生物标志物。粪便钙卫蛋白已广泛用于区分肠易激综合征和炎症性肠病，并用于监测克罗恩病(Crohn’sdisease)和溃疡性结肠炎的疾病活动。2016年发表的一项研究指示钙卫蛋白在早期脓毒症中作为生物标志物的作用(A.Larsson等人，“血浆钙卫蛋白作为早期脓毒血症生物标志物的表现：一项初步研究(Performanceofplasmacalprotectinasabiomarkerofearlysepsis:apilotstudy)”，《医学中的生物标志物(BiomarkersinMedicine)》，2016年7月14日，DOI:10.2217/bmm-2016-0032)。有迹象指示钙卫蛋白为一种局部的部位特异性标志物，并且因此确定在不同样品(诸如尿液、唾液、脑脊液、滑液)中以及也可能在活组织检查中钙卫蛋白的水平变得有意思。可在酶联免疫吸附测定法中确定钙卫蛋白，该酶联免疫吸附测定法为一种基于板的测定技术，其使用固定化在固体表面上的捕获抗体，并与样品中的抗原形成复合物。这种抗原将被形成复合物的特异性抗体检测到。然后这种复合物将被与酶连接的二级抗体结合。经由与底物温育以产生可测量的产物通过评估缀合酶活性来完成检测。这通常被称为夹心ELISA。ELISA通常在96孔(或384孔)聚苯乙烯板中进行，这些板将被动地结合抗体和蛋白。目前市场上有几种基于ELISA的钙卫蛋白测试。钙卫蛋白也可以比浊法方式确定，这允许测定法的自动化程度达到基于ELISA的测定法不可能达到的程度。在专利申请EP1739430A(AXISSHIELDASA)中公开比浊钙卫蛋白测定法的一个示例。后来，Nilsen、Tom等人，“一种用于全自动化临床分析仪的血清钙卫蛋白的新比浊免疫测定法”，《炎症杂志(JournalofInflammation)》2015年7月25日，第12卷，第45页至第52页，公开了一种用于全自动化临床分析仪的新比浊免疫测定法。钙在重组S100A8/S100A91的构象变化中的作用已由Gheibi等人进行了研究，《分子生物学(MolecularBiology)/分子生物学(MolekulyarnayaBiologiya)》，苏联科学院，俄罗斯，第50卷，第1期，2016年3月30日，第118页至第123页。本综述论述Ca2+的结合如何致使构象变化，并描述钙卫蛋白的生理和病理作用。市面上商业钙卫蛋白测定法的一个示例是专业用途的BühlmannfCAL涡轮钙卫蛋白比浊测定法：试剂试剂盒和校准物试剂盒。随着钙卫蛋白测定的日益普及，以及它们在诊断不断增加的疾病中的应用，无论样品的类型和样品的预处理如何，都需要确保测定法的准确度。
技术实现思路
一个目的是提供用于确定生物样品中钙卫蛋白浓度的改进的测定法，该测定法适用于不同来源的样品，并且表现出提高的准确度和可重复性。本专利技术人惊奇地发现，钙卫蛋白不仅在其天然状态下以多种不同的同种型存在于哺乳动物体内，而且它还会取决于样品的处置和处理而在取样时显著改变外观。不希望受任何理论束缚，专利技术人假定钙卫蛋白作为非特异性先天宿主防御机制中的中心组分，具有提高的适应于环境的能力。然而，人们似乎普遍认为钙卫蛋白非常稳定。就本专利技术人最佳所知，用于校准现有测定法的钙卫蛋白标准品，无论该测定法是基于ELISA还是比浊法，都使用四聚体形式。这种矛盾可导致真实浓度和检测浓度之间的偏差，这可在钙卫蛋白浓度用于诊断、预测或监测不同临床病症时引入不确定性。因此，本专利技术的第一方面涉及使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其中校准物缓冲液和/或反应缓冲液的选择由样品的特性决定。根据所述第一方面的一个实施方案，样品为锂肝素处理的血浆样品或血清样品，并且校准物缓冲液和/或反应缓冲液包含过量二价阳离子。根据所述第一方面的另一个实施方案，样品为EDTA处理的样品，并且校准物缓冲液和/或反应缓冲液包含EDTA。根据所述第一方面的又一个实施方案，样品为粪便提取物，并且校准物缓冲液和/或反应缓冲液包含EDTA。第二方面涉及使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其特征在于校准物缓冲液和/或反应缓冲液的选择由所述样品的特性决定。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170403 EP 17164618.51.一种使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其特征在于校准物缓冲液和/或反应缓冲液的选择由所述样品的特性决定。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为锂肝素处理的血浆样品或血清样品，并且所述校准物缓冲液和/或所述反应缓冲液包含过量二价阳离子。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为EDTA处理的样品，并且所述校准物缓冲液和/或所述反应缓冲液包含EDTA。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为粪便提取物，并且所述校准物缓冲液和/或所述反应缓冲液包含EDTA。


5.一种使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其特征在于所述校准物缓冲液包含EDTA和/或在添加所述反应缓冲液之前或与添加所述反应缓冲液同时将EDTA添加到所述样品中。


6.一种使用颗粒增强比浊免疫测定法(PETIA)确定样品中钙卫蛋白的方法，所述测定法包含固定化到颗粒的抗钙卫蛋白抗体或其片段、反应缓冲液和在缓冲液中的包含钙卫蛋白的校准物；其特征在于所述校准物缓冲液包含二价阳离子，并且在添加所述反应缓冲液之前或与添加所述反应缓冲液同时将过量二价阳离子添加到所述样品中。


7.根据权利要求1、5和6中一项所述的方法，其中所述抗钙卫蛋白抗体或其片段为针对从人粒细胞中提取的纯化的S100A8/A9异四聚体的抗体。


8.根据权利要求1、5和6中一项所述的方法，其中所述抗钙卫蛋白抗体或其片段为针对重组钙卫蛋白的抗体。


9.根据权利要求1、5和6中一项所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒的粒度在直径60nm至180nm，优选60nm至120nm，最优选80nm至100nm的区间内。


10.根据权利要求1、5和6中一项所述的方法，其中所述反应缓冲液选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃尔林·松德列哈根，卡特林·森德，汤姆·尼尔森，阿尔诺·大卫，
申请(专利权)人：根田股份有限公司，
类型：发明
国别省市：挪威;NO