利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰制造技术

本发明专利技术提供了利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，该方法是将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和植物学领域。具体地说，本专利技术涉及一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法。
技术介绍
在农业上，虫害问题一直是影响农作物产量的一个重要因素。人们每年要投入大量的人力、物力来抑制虫害，以提高作物产量。随着农业害虫对农药的抗性增加，以及出于保护环境和可持续性发展的考虑，迫切需要新的抗虫方法的出台。转基因抗虫植物的出现缓解了这一矛盾，为农业的发展作出了重大贡献，如转基因抗虫大豆，Bt抗虫棉等。然而，目前已陆续有研究报道，随着时间的推移，各种转基因抗虫植物的抗性正在下降，以前大规模罕见的虫害现象又开始死灰复燃。 因此，迫切需要找到新的方法，开发出新型的转基因抗虫植物，以有效地和/或特异性地对抗植物的病虫害。专利技术人此前开发出了一种利用RNA干扰机制、以植物作为载体来抑制昆虫生长的方法(专利申请号200610119029. 7，该专利申请全文纳入本文作为参考)。该方法将包含正向和反向昆虫基因(或片段)序列导入到植物内，在植物中表达昆虫基因的dsRNA，当昆虫在取食了转基因植物后，体内的靶基因通过RNA干扰途径被抑制，从而使害虫的生长发育受到抑制。由于可以根据某种昆虫某个特定基因的序列设计专一的dsRNA，这一技术能够有选择地抑制昆虫特定基因的表达，从而为开发更有效和更安全的转基因抗虫植物开辟了新方向(Mao等人，2007)。RNA干扰效率和有效的靶基因是这一技术得以应用的关键。然而，仍然需要进一步改进来提高昆虫对诸如dsRNA分子的吸收，从而提高RNA干扰的作用。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术人经过研究发现，植物半胱氨酸蛋白酶能够增强昆虫中肠对诸如dsRNA分子、棉酚等大分子的通透性。因此，其与植物介导的昆虫RNA干扰技术相结合能显著加强植物介导的昆虫RNA干扰作用。本专利技术的第一个方面提供了一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA 干扰的方法，所述植物的细胞内已转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物，所述方法包括将表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入所述植物的细胞、组织或器官中。本专利技术提供了一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。优选的，所述的植食性昆虫是鳞翅目昆虫。本专利技术另一方面提供了一种提高植物抗虫性的方法，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中， 从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。本专利技术另一方面提供了一种植物细胞，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因 dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物。本专利技术还有一个方面提供了含有上述植物细胞的转基因植物、其组织或其后代。本专利技术另一方面提供了一种生产转基因植物的方法以及用该方法获得的转基因植物，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括使转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物的亲本植物与转入了表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物的亲本植物杂交，筛选并获得所述昆虫基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表达的植物后代。本专利技术另一方面提供了一种转基因植物、其组织或其后代，其含有权利要求9-11 任一项所述的植物细胞。本专利技术的另一方面提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。本专利技术的其它优点可从下文的详细描述和实施例得知。附图说明 图1显示了 (ihCP与CABM307的序列一致性分析，结果显示(ihCP与CAB54307在核苷酸和蛋白水平存在微小差异。图IA是(ihCP与CAB54307在核苷酸水平上的比对(开放阅读框)。方框部分代表两者的差异部分。图IB表示(ihCP与CAB54307在蛋白水平上的比对。标注有“*”代表两者的保守部分。图2显示了 (ihCP和AtCP导入细菌中的表达。图2A是所用载体的示意图，其中利用T7启动子驱动Venues，GhCP或AtCP融合蛋白的表达。图2B是分别提取表达Venues， (ihCP和AtCP的细菌总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳的结果，其中Mark表示蛋白分子标记， 单位KD为千道尔顿。图3表明通过棉铃虫中肠中棉酚浓度的检测，发现(ihCP和AtCP能够增强棉铃虫对棉酚的通透性。图3A 将表达Venus或(ihCP的E. coli细胞分别与人工饲料混合，选取生长一致的3龄棉铃虫分成两组，分别喂以上述人工饲料。进食两天后，移至含有0. 棉酚浓度的人工饲料，继续培养一天。用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。图3A中左侧柱表示Venus,右侧柱表示GhCP。图3B 将表达Venus或AtCP的E. coli细胞分别与人工饲料混合，进行与图3A中类似的昆虫饲喂试实验后，用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。图3B中左侧柱表示Venus，右侧柱表示AtCP。图4是实时定量PCR检测GSTl在棉铃虫中肠的转录本。图4A显示了昆虫饲喂实验示意图。图4B显示RT-PCR检测进食野生型拟南芥Col-O (浅色)或转基因拟南芥 AtdsGSTl (深色)两天后昆虫中肠GSTl相对于内标ACT的表达量。图4C显示进食转基因拟南芥AtdsGSTl相对于进食野生型拟南芥Col-O的幼虫中GSTl的比例(进食转基因拟南芥AtdsGSTl幼虫中GSTl的表达量/进食野生型拟南芥Col-O幼虫中GSTl的表达量)。图中=Venus 在饲喂拟南芥之前，先用表达Venus的E. coli细胞与人工饲料混合，喂养生长一致的3龄棉铃虫两天做预处理AhCP 用表达(ihCP代替Venus的E. coli细胞，进行预处理；AtCP 用表达AtCP代替Venus的E. coli细胞，进行预处理。图5表示将(ihCP导入拟南芥中表达。图5A是载体构建示意图；图5B是RT-PCR 检测转基因拟南芥At(ihCP中(ihCP的转录本，其中泳道5为阴性对照。图6表示通过ATChCP饲养的棉铃虫对棉酚的通透性增强；在进食dsGST， dsCYP6AE14植物组织后，RNAi的效果更加明显。图6A 选取生长一致的3龄棉铃虫分成两组，分别喂以野生型拟南芥(Col-O)或转基因拟南芥ATChCP(ATChCP)。两天后，移至含有 0. 棉酚浓度的人工饲料，继续培养一天。用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。 图6B =RT-PCR检测进食野生型拟南芥Col-O或转基因拟南芥AtdsCYP6AE14两天后棉铃虫中肠CYP6AE14相对与内标ACT的表达量。WT 用Col-O喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天，分成两组，一组继续进食Col-O (浅色)，一组转移至AtdsCYP6AE14 (深色)继续培养两天后CYP6AE14的表达。AtGhCP 用At(ihCP喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天后，分成两组，进行类似的饲喂实验后CYP本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫ＲＮＡ干扰的方法，所述植物的细胞内已转入了表达昆虫基因ｄｓＲＮＡ的构建物，其特征在于，所述方法包括将表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入所述植物的细胞、组织或器官中。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓亚，毛颖波，薛学义，林芝萍，王凌健，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31