本发明专利技术涉及结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断试剂盒及其制作方法和应用方法。是利用编码１５个氨基酸（Ｇ４Ｓ１）３的ｌｉｎｋｅｒ，将结核分枝杆菌特异抗原Ｒｖ３８７５和Ｒｖ３８７４的编码基因（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）串联起来后，插入大肠杆菌表达载体，并在大肠杆菌中实现了Ｒｖ３８７５和Ｒｖ３８７４融合蛋白的高效表达和纯化。该重组蛋白至少包含了８个可用于细胞免疫诊断的Ｔ细胞表位，并以该蛋白为基础结合人ＩＦＮ－γ的酶联免疫分析技术，建立了全血ＩＦＮ－γ释放分析方法的诊断试剂盒以及诊断方法，可以用于结核病和结核杆菌感染者的早期、特异性诊断和筛检。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期和特异的检测方法， 特别是一种结核病抗原特异的全血IFN-Y诊断试剂盒及其制作方法和应用方法。
技术介绍
结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。 据世界卫生组织估计，全世界有超过1/3的结核杆菌感染者，其中的10%在其一 生中可以发展成为结核病病人。因此，筛检感染者在结核病的防治甚至最终的 消灭中扮演中极其重要的作用。现有的诊断技术对结核杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采 用结核菌素试验(TST)来诊断结核杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍 生物(PPD)，该成份是一种混合物，且非结核分枝杆菌特异的。其检测结果可 被现在临床上广泛使用的疫苗——卡介苗免疫所干扰。从1921年专利技术卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人 接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响。对结核病病人的诊断技术包括痰涂片抗酸染色或痰菌培养，阳性率仅 40%-60%左右；肺部X射线检査肺部病理改变也仅在具有典型的临床症状后才 能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率高。因此， 必须尽快研究结核病和结核杆菌感染者的早期、快速、特异和敏感的诊断方法。
技术实现思路
本专利技术是针对上述诊断方法的困难和不足之处，提出一种结核病抗原特异 的全血IFN-Y诊断方法，可实现对结核病病人和感染者早期、快速、特异的诊断， 在阻断结核病的传播和流行，对结核病的控制具有重大意义。本专利技术是基于以下原理来实现的。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生IFN-Y，后者发挥抗 结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核杆菌相遇后， 会再次分泌产生IFN-Y，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-Y产生量与机体 是否感染或发病密切相关。因此如果采用结核杆菌特异的抗原在体外刺激感染 者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核杆菌抗原特异的IFNi， 而非结核杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-Y的量与未用抗原刺激产生的 量相近，从而实现诊断的目的。因此发现并寻找结核杆菌特异性抗原的鉴定对发展新一代的诊断试剂具有 重要价值和意义。结核杆菌和卡介苗比较基因组学的研究揭示了卡介苗缺失了 几个区(regions of difference, RD)，其中之一命名为RD1区。进一步研究证实RD1区集中在结核杆菌复合体(人型结核杆菌、牛型结核杆菌)，而在世界各地的卡介苗菌株中全部缺失。大量的研究证实RD1区编码的抗原Rv3875，是结核杆菌培养过程中 早期产生的分泌性蛋白质，相对分子质量6kDa，或24kDa， 9.9kDa等，主要是 由于该蛋白在自然情况下以多聚体形式存在。该蛋白能够刺激强的迟发性变态 反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的IFN-y 。进一步发现，能 够刺激机体产生特异性细胞免疫应答的表位分别是是位于该蛋白的以下肽段，艮卩P. 1-16.............................................................MTEQQWNFAGIEAAASP.9—24............................................................AGIEAAASAIQGNVTSP. 17-32..........................................................AIQGNVTSIHSLLDEGP.57-72 ..........................................................KWDATATELNNALQNLP.80—95 ..........................................................GQAMASTEGNVTGMFARD1区编码的另外一个抗原Rv3874，也是结核杆菌培养过程中早期产生的 分泌蛋白质，相对分子质量10kDa，也是一种强免疫原性蛋白。能够刺激机体产 生特异性细胞免疫应答的T细胞表位分别是位于该蛋白的以下肽段，即Pl.l-18........................................................MAEMKTDA ATL AQE AGNFP2.13-28.......................................................QEAGNFERISGDLKTQP4.55-72 .......................................................VVRFQEAANKQKQELDEIP7.75-92 ........................................................NIRQAGVQYSRADEEQQQP8.85—100 ......................................................RADEEQQQALSSQMGF因此，本专利技术所选用的抗原Rv3875和Rv3874具有结核病特异诊断的上述 潜在的T细胞表位，并构成本专利技术抗原选择的依据。首先由于这些蛋白的分子量较小，从结核杆菌的培养物中直接分离纯化较 为困难；国外尽管采用合成肽的方法来解决上述困难，肽合成的成本非常高， 由此建立的临床应用试剂盒的成本大大增加。最后，单独通过基因工程技术获 得上述抗原的表位，由于体外和体内的差异，表达的产物如国内外已经报道的， 也容易因为形成包涵体而失去蛋白质的活性。为了克服这些困难和缺陷，本专利技术提出的重组蛋白，就是将已经公开的， 已知的Rv3875和Rv3874(均来源于美国GenBanK数据库)的基因连接在一起，克隆入大肠杆菌表达载体进行工程化表达，然后进一步大规模纯化重组蛋白。 可集中两种抗原的T细胞表位和免疫原性的优势，达到优势互补，为临床大规 模生产应用奠定了基础。尽管国内外已有研究报道用上述蛋白作为结核病患者的血清学诊断，但由于Rv3875和Rv3874蛋白含有大量上述的T细胞表位，主要刺激机体的细胞免 疫应答，因而将上述蛋白作为抗原检测患者体内的产生的相应抗体实现诊断结 核病的目的并未达到。本专利技术和这些研究报道有显著和本质的区别。在获得本 专利技术提出的特异重组蛋白的基础之上，本专利技术进一步提出全血IFN-Y释放分析方 法，该方法是通过分析结核杆菌抗原特异的细胞免疫应答而诊断结核病患者和 结核病感染者，并建立了结核病抗原特异的全血IFN-y诊断试剂盒。本专利技术提出的试剂盒由两部分组成，一是结核杆菌特异抗原Rv3875-Rv3874融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列特征为SEQ.ID.No.6，并且至少包含本专利技术题及 的两种以上的T细胞表位，这些T细胞表位分别位于该蛋白氨基酸组成的第1 位到第16位(Rl-16: MTEQQWNFAGIEAAAS);第9位到第24位(P,9-24: AG正AAASAIQGNVTS);第17位到第32位(P.1本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断试剂盒及在结核病和结核杆菌感染者的早期、快速和特异性诊断的应用方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范雄林，
申请(专利权)人：范雄林，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]
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