本发明专利技术公开了一种以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒的核酸反应体系内包括用于扩增目的基因靶向序列的若干个引物对；且体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在25-100mmol/L之间，镁离子浓度在1.5-3.0mmol/L之间，甘油浓度在10%-14%之间。该试剂盒不经过核酸的分离和纯化过程，也不需对全血样本进行任何前处理，即可从含有大量抑制核酸扩增物质的全血样本中高效率地放大目的核酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸扩增
，具体涉及一种。
技术介绍
基于聚合酶链反应(PCR)的核酸扩增技术是一种将极微量的核酸样本扩大数百万甚至数亿倍的现代分子生物学技术，以其简单、快速、特异等优点在生物科学各个领域被广泛使用。通常，PCR扩增需要基因组DNA作为模板，而基因组DNA是从外周血中提取而得。目前常用于提取外周血中DNA的方法有酚/氯仿提取法、盐析法、碘化钾法、煮沸裂角军法等Carpi FM, DiPietro F, Vincenzetti S，et al. Human DNA extraction methods patents and applications. Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2011,5(1) 1-7.基于这些方法原理开发了很多商品化的DNA提取试剂盒。尽管如此，提取DNA的操作仍然繁琐而费时，DNA质量也参差不齐，而且容易造成样本间交叉污染。如果不经过DNA提取，而直接从全血进行PCR扩增，则可以大大节约试验时间和成本，同时避免因繁多步骤造成的样本间交叉污染。Kogan SC等最早采用简单的加热法将血液样本煮沸后，取上清液用于PCR扩增，取得了不错的结果Kogan SC, Doherty Μ, Gitschier J. An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences. Application to hemophilia A. The New England Journal of Medicine 1987,317(16) :985-990. ;;tM，Mercier B,Mercier B,Gaucher C, Feugeas 0, et al. Direct PCR from whole blood, without DNA extraction. Nucleic Acids Research 1990，18 :5908.禾口 Mccusker J 等Mccusker J, Dawson MT，Noone D, et al. Improved method for direct PCR amplification from whole blood. Nucleic Acids Research 1992,20(24) :6747.在PCR扩增前分别采用95°C预加热或3个预变性循环的方法以消除血液中PCR抑制成分的影响，实现了从全血直接进行DNA扩增；Ohhara M等利用超声技术对血液样本进行预处理之后也实现了 PCR扩增Ohhara Μ, Kurosu Y， Esumi Μ. Direct PCR of whole blood and hair shafts by microwave treatment. Biotechniques 1994,17 :726,728. ] 虽然这些方法以全血为起始模板实现了 PCR扩增， 但仍需对血液样本进行预处理，增加了操作步骤，而且条件难以控制、重复性差、不能形成商品化试剂盒、不利于推广使用。此外，国内外学者还相继报道了多种从全血直接进行 PCR ±曾的^titYang YG, Kim JY, Song YH, et al. A novel buffer system, AnyDirect, can improve polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation. Clinica Chimica Acta 2007，380 (1-2) :112-117.。然而，这些方法中所加试剂并没有完全公开。因此，研究和开发全血直接PCR扩增法尤为必要。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂盒，解决了现有技术中以全血为起始模板直接进行核酸扩增时需要对全血进行预处理造成操作步骤繁琐等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案是一种以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒的核酸反应体系内包括用于特异性扩增目的基因靶向序列的若干个引物对、PCR缓冲液、dNIPs、 MgCl2, Taq DNA聚合酶；且体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在25-lOOmmol/L之间，镁离子浓度在1.5-3. Ommol/L之间，甘油浓度在10% -14%之间。优选的，所述核酸反应体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在25-lOOmmol/L之间，镁离子浓度在1.5-3. Ommol/L之间，甘油浓度在10% -14%之间。优选的，所述核酸反应体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在40-80mmol/L之间，镁离子浓度在1. 5-3. Ommol/L之间，甘油浓度在10% -14%之间。最优选的，所述核酸反应体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在50mmol/L，镁离子浓度在2mmol/L，甘油浓度在10%。优选的，所述PCR缓冲液包括Tris. Cl、氯化钾、硫酸铵、氯化镁；_20°C下pH值在 8. 0-9. 0 间。所述核酸反应体系的终浓度组成为PCR缓冲液含 25-100mmol/L Tris,50mmol/L KCl ；dNTPs0. 01 0. 2mmol/L ；引物序列0. 01 0. 4ymol/L ；TaqDNA聚合酶0. 01 0. 025U/y L ；MgCl21. 5-3. 0mmol/L ；甘油10% -14%。优选的，所述核酸？反应体系的终浓度组成为PCR缓冲液含 25-100mmol/L Tris,50mmol/L KCl ；dNTPs0. 2mmol/L ；引物序列0. 4μ mol/L ；TaqDNA聚合酶0. 025U/y L ；MgCl21. 5-3. Ommol/L ；甘油10% -14%。优选的，所述核酸？反应体系的终浓度组成为PCR缓冲液含 50 100mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，50mmol/L KCl ；dNTPs0. 2mmol/L ；引物序列0. 4 μ mol/L ；TaqDNA聚合酶0. 025U/y L ；MgCl21. 5-2. 5mmol/L ；甘油10% -12%。本专利技术还提供了-一种从全血样本中直接进行核酸扩增的方法，其特征在于所述方法包括取全血样本作为起始材料，将全血样本加入权利要求1所述的以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂盒或将权利要求1所述的以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂体系加入全血样本中，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物的步骤。优选的，所述方法中全血样本选自人或动物的液体血液或干血。优选的，所述方法中液体血液为加入抗凝剂的血液或不加抗凝剂的血液；所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钾盐、乙二胺四乙酸三钾盐、草酸钠、草酸钾、肝素和枸椽酸钠的一种或两种以上的组合。优选的，所述方法中干血为加入抗凝剂的血液或不加抗凝剂的血液附着于固体表面干燥形成的血块。本专利技术的又一目的在于提供一种以全血为起始模板进行核酸扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种以全血为起始模板进行核酸扩增的反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒的核酸反应体系内包括用于特异性扩增目的基因靶向序列的若干个引物对、ＰＣＲ 缓冲液、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶；且体系内三羟甲基氨基甲烷的浓度在２５－１００ ｍｍｏｌ／Ｌ之间，镁离子浓度在１．５－３．０ ｍｍｏｌ／Ｌ之间，甘油浓度在１０％－１４％之间。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪维鹏，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。