本发明专利技术公开了一种结合荧光定量ＰＣＲ的基因分型检测方法，解决了荧光定量的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法引物延伸错配率高，基因分型检测特异性差的缺点。本发明专利技术提供的解决方法是分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物３’端倒数第３－７个碱基中，任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入１个人为错配碱基，从而使引物的错误延伸率降低来达到目的。运用本发明专利技术可以大大提高荧光定量的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法用于ＳＮＰ基因分型检测的特异性和准确性。
Genotyping method combining fluorescent quantitative PCR
The invention discloses a method for using fluorescent quantitative PCR genotyping method to solve the SYBR Green method of TaqMan primers extension mismatch rate, genotyping shortcomings of poor specificity. The solution provided by the invention is respectively in wild type and mutant allele specific primer 3 'end of last third - 7 bases, one base position to transition or transversion way to introduce 1 people with base for wrong, so that the primer elongation decreased to achieve the purpose of error. The invention can greatly improve the specificity and accuracy of the SYBRGreen method of fluorescence quantification for SNP genotyping detection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测方法，具体地说涉及一种结合荧光定量PCR进行基因分型检测的方法。二.
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。实时荧光定量PCR 就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量 分析。其原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的 进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧 光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增 曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶 段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断 产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模 板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有 在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可 以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引 入了两个非常重要的概念荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置 是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数被称为CT值(threshold value )。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特 异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指 示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。非探针类常用的染料是SYBR Green I。 SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA 结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理 想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520咖。在PCR反 应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地惨入DNA双链后，发射荧光 信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。我们利用SYBR Green I染料法可以在反应末尾对扩增产物进行熔解曲线分析。在熔解 曲线分析过程中，随着温度从低于产物熔解点缓慢升到高于产物熔解点，定量PCR仪连续监 测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。熔解曲线分析可用于产物的分析 鉴定，同时避免了耗时的电泳。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组水平上由单个碱 基变异引起的DNA多态性，在人群中的发生频率大于1%，它是人类可遗传的变异中最常见 的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个 碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP 一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP 的二态性，非此即彼，在基因组筛选中3,往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这 就利于发展自动化技术筛选或检测SNP。目前已建立的SNP分型方法很多。包括传统的PCR—RFLP、 PCR—单链构象多态性(single —strand eonformation polymorphism, SSCP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR， AS—PCR)和直接测序.以及近几年发展起来的变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPIX)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix— assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MAU)I—T0F MS)、动态等位基因特异性杂交(dvnamic allele specific hybridization DASH)和DNA芯片 等技术。尽管这些新方法具有通量高、易于自动化等优点，但其极高的成本和昂贵的仪器设 备是许多中、小型实验室所无法承担的。利用荧光定量方法来进行SNP分型检测的方法也被广泛应用，比较常用的是Taq腿n探针和 MGB探针法。探针法价格昂贵，对引物设计要求很高，并且受限于目前国内研发水平。我们可以利用荧光染料SYBRGreenI法来进行SNP分型。基于SNP的二态性，假设某基 因型存在A/G两态性，我们分别设计针对A型和G型的引物，理论上对于AA纯合型，只和A 引物结合；对于GG型，只和G引物结合；对于AG型，可以和两型引物都结合，从而达到分 型的目的。反映在扩增曲线图上面就是对于AA型，加入引物A的反应管有扩增曲线和其对应的CT 值，而G引物反应管无扩增曲线和CT值；对于GG型，加入引物G的反应管有扩增曲线和其 对应的CT值，而A引物反应管无扩增曲线和CT值；GA型则两者都有扩增曲线和CT。这种结合荧光定量SYBRGreenI法的SNP分型法，有SYBR Green I法的所有优点。比如 由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程 序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线 分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色 多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SY服Green I的灵敏 度很高。但也正由于SY服GreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级 结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性，并且影响SNP分型检测定性判 断的准确性。人们希望在利用这种结合荧光定量SYBRGreen I法的SNP分型法时，进一步提高定性分 析的准确性。4三.
技术实现思路
(1) 要解决的技术问题提供一种即有荧光染料SYBRGreenI检测法的方便、通用、便宜的优点，又能提高其SNP 分型检测特异性的荧光定量PCR基因分型检测方法。(2) 技术方案本专利技术的专利技术目的是这么实现的先针对SNP样本进行引物设计；利用反相引物和SNP 检测引物进行荧光定量反应，使得每个样本分别获得两种等位基因扩增产物的Ct值和熔解曲 线分析结果；最后根据扩增曲线和熔解曲线判断结果；在引物设计时，对引物进行特殊修饰， 分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3'端倒数第3-7个碱基中进行化学修饰，修饰 方法是在任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入1个错配碱基。通过这种化学修饰从而使 引物的错误延伸率降低，提高分型检测的特异性，增强检测结果的专一性。本专利技术的一个优选例是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结合荧光定量ＰＣＲ的基因分型检测方法，步骤包括：引物设计，荧光定量ＰＣＲ，根据扩增曲线和溶解曲线判断结果；其特征在于，引物的特殊修饰，分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物３’端倒数第３－７个碱基中进行化学修饰，修饰方法是在任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入１个错配碱基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：穆海东，汪宁梅，候洪杰，黎飒，
申请(专利权)人：上海裕隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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