多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法，该液体芯片由通用引物和至少两种核酸检测系统组成，每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针Ｐ１和磁性微球标记的探针Ｐ２组成，探针Ｐ１和Ｐ２分别与靶核酸序列两端互补，Ｐ１和Ｐ２之间不互补；多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成；不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记Ｐ１；本发明专利技术液体芯片采用通用引物ＰＣＲ方法，结合多色量子点组合微球标记技术与磁性分离技术，为病原微生物的快速侦检及其它核酸检测项目提供了一种操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的新方案。

Liquid chip with multicolor quantum dot composite microsphere coding and preparation method and detection method thereof

The invention discloses a multi-color quantum dot composite microspheres, encoding the liquid chip and its preparation method and detection method of the liquid chip by universal primers and at least two nucleic acid detection system, each kind of nucleic acid detection system by probe P2 probe P1 multicolor quantum dot composite microspheres and magnetic microspheres labeled probe P1 labeled. And P2 respectively with the target nucleic acid sequences are complementary, complementary between P1 and P2; multi-color quantum dot composite microspheres by sphere and loading multi-color quantum dots in the sphere of composition composition; different nucleic acid detection system respectively with the same size but the sphere fluorescence emission wavelength of multi-color quantum dot composite microspheres labeled P1 different; the invention of liquid chip using the universal primer PCR method, combined with multi-color quantum dot composite microspheres technique and magnetic separation technology for pathogenic micro Biological rapid detection and other nucleic acid detection project provides a simple, high throughput, high sensitivity, good repeatability of the new program.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种液体芯片，特别涉及一种多色量子点组合微球编码的液体芯片， 还涉及该液体芯片的制备方法和检测方法。
技术介绍
微生物的种类很多，其中传染性最强、危害性最重的是细菌、衣原体和立克次体类 病原微生物。病原微生物的传统检测是以病原微生物表型特征为基础，主要采用分离培养 结合形态特性、生化鉴定和免疫分析等方法，存在操作复杂耗时、条件要求苛刻、阳性率低 等缺点，且许多细菌的生化特征和抗生素敏感型等表型特征不稳定，易受到基因调控、质粒 获失及技术操作等方面的影响。近年来，以分子生物学为基础的鉴定方法如质粒分析、核酸 杂交、限制性片段多态性分析和聚合酶链式反应(PCR)等，克服了上述病原微生物传统检 测方法存在的缺点和客观因素对其产生的影响，大大提高了检测的特异性和准确度，其中 生物芯片技术凭借其高通量优势在病原微生物的快速侦检中发挥了重要作用。但常规生物 芯片为固体芯片，由于空间位阻的影响，核酸杂交效率较低。为克服此缺点，液体芯片应运 而生。液体芯片，又称悬浮阵列，该技术的核心是将聚苯乙烯微球用荧光染色的方法进 行编码，然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定核酸的探针。 应用时，将检测样本与多种连有特定核酸探针的微球同时进行杂交反应，反应完成后，仪器 通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度，从而对靶核酸进行定 量检测。由于整个反应在液相中完成，反应速度快，杂交效率高，并可以在一个微量反应体 系中同时检测多达上百条靶序列，尤其适合病原微生物的快速侦检。然而，近年研究结果显 示，液体芯片技术尚存在灵敏度较低、重复性较差等不足，其原因主要是不同荧光标记物的 发射光谱在液相中广泛重叠，导致大量假阳性结果产生，限制了液体芯片技术在病原微生 物侦检中的进一步推广应用。因此，寻找一种能以不同颜色分别标记探针，且发光强度高， 不易淬灭，光谱之间重叠少的荧光标记物是提高液体芯片检测灵敏度和重复性的关键。量子点(quantum dots, QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子点是一种 由周期表中II-VI族或III-V族元素组成，直径在1 IOnm之间，能够接受激发光产生荧 光的半导体纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多独特的理化特性① 发射波长可调谐，可通过控制量子点的粒径大小来调节其发射荧光的颜色；②激发波长范 围宽，从紫外区到近红外区，可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点；③发射峰狭 窄且对称，半高峰宽通常为25 45nm ；④荧光强度高且稳定，对光漂白有强烈的抵制作用。 量子点的优越荧光性能使其作为新型荧光标记物，在肿瘤活体成像与靶向治疗、分子诊断 等领域中已显示出巨大潜力。但是直接用不同粒径的量子点制备多色荧光标记探针时尚存 在如下问题，即不同粒径量子点_探针复合物的最佳杂交条件是不一致的，因而难以同时 实现多色荧光标记探针的检测条件优化，这对条件要求较高的核酸杂交实验结果的影响尤为明显。为克服以上问题，有研究者采用将多个量子点组装于同一粒径的微球内的方式来 实现标记物质的均一化，通过控制量子点装配的种类和数量实现了超过1000种颜色的DNA 标记，为多色量子点的生物标记奠定了基础。
技术实现思路
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种多色量子点 组合微球编码的液体芯片，目的之二在于提供所述液体芯片的制备方法，目的之三在于提 供所述液体芯片的检测方法，从而为病原微生物的快 速侦检及其它核酸检测项目提供一种 操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的新方案。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案1、多色量子点组合微球编码的液体芯片，由通用引物和至少两种核酸检测系统组 成，每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针Pl和磁性微球标记的探针P2组 成；所述探针Pl和P2分别与靶核酸序列两端互补，Pl和P2之间不互补；所述多色量子点组 合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成；所述多色量子点组合物是从η种 具有不同荧光发射波长的量子点中任取m种组合而成，η和m均为正整数且m < η ；不同核 酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针Ρ1。进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS, CaSe, CaTe, ZnO, ZnS、ZnSe, ZnTe, SrS> SrSe > SeTe、CdS、CdSe > CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs > InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/ CdS、CdS/PbS、CdS/Cd (OH) 2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/ HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn, ZnS:Cu, CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量 子占.-J /、、、 进一步，所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS 中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。2、所述多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法，包括以下步骤a、设计并合成通用引物；b、制备至少两种核酸检测系统按照步骤bl b3制备每种核酸检测系统，不同 核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针 Pl ；bl、根据靶核酸序列设计并合成探针Pl和P2，并将探针Pl和P2的一端分别用X 标记；b2、制备η种具有不同荧光发射波长的量子点，从中任取m种组成多色量子点组合 物，再将其装载入球体中制成多色量子点组合微球；将多色量子点组合微球用Y标记后，与 步骤bl所得X标记的探针Pl通过X与Y的特异性结合进行偶联，制得多色量子点组合微 球标记的探针Pl ；b3、将磁性微球用Y标记后，与步骤bl所得X标记的探针P2通过X与Y的特异性 结合进行偶联，制得磁性微球标记的探针P2。进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS, CaSe, CaTe, ZnO, ZnS、ZnSe, ZnTe,SrS> SrSe > SeTe、CdS、CdSe > CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs > InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/ CdS、CdS/PbS、CdS/Cd (OH) 2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/ HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS本文档来自技高网...

【技术保护点】
多色量子点组合微球编码的液体芯片，其特征在于：由通用引物和至少两种核酸检测系统组成，每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针Ｐ１和磁性微球标记的探针Ｐ２组成；所述探针Ｐ１和Ｐ２分别与靶核酸序列两端互补，Ｐ１和Ｐ２之间不互补；所述多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成；所述多色量子点组合物是从ｎ种具有不同荧光发射波长的量子点中任取ｍ种组合而成，ｎ和ｍ均为正整数且ｍ≤ｎ；不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针Ｐ１。

【技术特征摘要】
多色量子点组合微球编码的液体芯片，其特征在于由通用引物和至少两种核酸检测系统组成，每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2组成；所述探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补，P1和P2之间不互补；所述多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成；所述多色量子点组合物是从n种具有不同荧光发射波长的量子点中任取m种组合而成，n和m均为正整数且m≤n；不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1。2.根据权利要求1所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片，其特征在于所述量 子点选自 MgS> MgSe> MgTe> CaS> CaSe> CaTe> ZnO、ZnS> ZnSe> ZnTe> SrS> SrSe> SeTe、CdS> CdSe > CdTe > BaS> BaSe > BaTe > HgS> HgSe > HgTe > PbSe、CaAs > InP、InAs > InCaAs > ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/ Cd (OH)2, CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/ HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn 禾口 CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。3.根据权利要求2所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片，其特征在于所述量 子点选自 CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS 中的任一种，以及以上述 任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。4.权利要求1所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法，其特征在于 包括以下步骤a、设计并合成通用引物；b、制备至少两种核酸检测系统按照步骤bl b3制备每种核酸检测系统，不同核酸检 测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针Pl ；bl、根据靶核酸序列设计并合成探针Pl和P2，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗阳，王珏，府伟灵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]