靶向药物疗效相关基因ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片，所述检测液相芯片，主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因ｍＲＮＡ的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括５’端能与对应的目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列、间隔臂序列、３’端能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因ｍＲＮＡ与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括５’端能与目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列、间隔臂序列、３’端能与标记探针互补配对的序列。本发明专利技术还公开了运用该液相芯片对受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因ｍＲＮＡ表达水平检测的方法。本发明专利技术检测过程无需ＲＮＡ提取、逆转录、ＰＣＲ等步骤，检测结果受样本中ＲＮＡ的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，由于液相芯片技术使多指标并行检测成为了现实，在一次检测中可设置多个内参基因，使检测结果更为可靠。

Targeted drug efficacy related gene mRNA, expression level detection, liquid phase chip and detection method

The invention discloses a receptor tyrosine kinase inhibitors targeting drug efficacy related gene mRNA expression level detection liquid phase chip, the detection of liquid chip, mainly include: support probe coupling and amine modified microspheres; connecting support probe and the target gene mRNA support extension probes, each probe includes a support extension the 5 'end to specific sequence, the spacer sequence, 3' end combined with the target gene of mRNA corresponding to the specific sequence and support probe corresponding to the complementary sequence; connecting the mRNA with the signal of the target gene amplification component extension probes, each probe amplification extension comprises 5 'end can be combined with the target gene mRNA specific sequence, spacer sequence, 3' end and marker sequence complementary probe. The invention also discloses a method for detecting the expression level of the receptor related therapeutic gene mRNA of the receptor tyrosine kinase inhibitor by using the liquid phase chip. The detection process without RNA extraction, reverse transcription, PCR and other steps, the detection results affected by the quality of RNA in small sample, ensure the accuracy of test results; on the other hand, because the liquid chip technology makes the multi index parallel detection has become a reality, in a test set a number of reference genes, the the detection result is more reliable.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及受体酪氨酸激酶抑制剂类。
技术介绍
酪氨酸激酶在细胞内信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理过程，其异常表达将导致细胞增殖调节紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移、肿瘤新生血管的生成、肿瘤的化疗抗性密切相关，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发已成为国际上抗肿瘤药物研究的热点。 酪氨酸激酶包括受体型和非受体型两种，受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够与配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。已发现50多种不同的RTKs，主要类型包括①表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体，包括EGFR、HER2、ErbB4等成员；②血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)受体，包括PDGFRα、PDGFRβ、集落刺激因子1受体、干细胞生长因子受体(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT)、FLK2/FLT3等成员；③胰岛素和胰岛素样生长因子-1(insulin and insulin-like growth factor-1，IGF-1)受体，包括胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor I receptor，IGF-1R)等成员；④神经生长因子(nerve growth factor，NGF)受体；⑤成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)受体；⑥血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)受体，包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)等成员。 目前，肿瘤治疗的靶向治疗药物主要有两类，一类是受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)，主要包括吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)、厄洛替尼(Erlotinib，Taceva)等；另一类是单克隆抗体类靶向药物，包括西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(Vectibix)等。受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物通过扩散进入肿瘤细胞，与受体胞内段激酶结合区结合，从而抑制受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。 TKI类靶向药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大。大量的临床研究已经证实，TKI的疗效/毒副作用与患者体内某些受体酪氨酸激酶相关基因的mRNA表达水平直接相关，它们分别是 (1)靶向治疗与表皮生长因子受体(EGFR) 表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要靶标，FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)以及抗EGFR抗体药.但临床运用表明这些靶向药物仅对部分病人有效.临床研究已经证实以EGFR通路为靶标的靶向药物疗效与肿瘤组织中EGFR基因mRNA表达水平密切相关，即EGFR基因表达水平高的患者对靶向药物敏感，反之表达水平低的患者表现药效较低.因此，美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年临床指南中推荐患者在接受靶向药物治疗之前，进行EGFR基因表达水平检测，确定是否接受靶向治疗，降低治疗费用，节省宝贵的医治时间. (2)伊马替尼与干细胞生长因子受体(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT) 干细胞生长因子受体(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT)是血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族成员之一，c-KIT原癌基因编码的KIT蛋白是一种跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族。研究表明，KIT基因表达产物及其配体是人类多种组织细胞生长发育的重要调控因素，与肿瘤的发生密切相关。甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate，STI571，格列卫)，属2-苯基-氨基嘧啶的衍生物，是一种小分子口服受体酪氨酸激酶抑制剂。2002年经FDA批准用于临床，已成功应用于胃肠道间质瘤(GIST)和慢性髓细胞性白血病(CML)，临床疗效令人振奋。其作用机理在于药物结合于KIT蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。 大多数肿瘤细胞中都有KIT蛋白表达，而且表达水平差异很大。临床研究已证实KIT表达水平与胃肠道间质瘤伊马替尼疗效和生存期呈正相关，即表达水平高的患者对伊马替尼药物敏感，反之表达水平低的患者表现部分耐药。因此，ASCO报道特别提醒胃肠道间质瘤应用伊马替尼前必须检测证实KIT阳性。 (3)靶向治疗与胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor I receptor，IGF-1R) 胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)是靶向治疗的重要靶标，IGF-1R的信号转导途径与肿瘤的发生密切相关。抑制IGF-1R的活性，可以有效控制肿瘤细胞的生长和转移，增强肿瘤对化疗、放疗的敏感性。以IGF-1R为靶标的治疗主要有IGF-1R单克隆抗体、反义寡核苷酸、IGF-1R单克隆抗体、小分子激酶抑制剂等。IGF-1R的信号转导还可引起细胞的恶性化以及细胞粘附性的改变。目前IGF-1R已经成为特异性治疗肿瘤的热点靶标。大量临床研究表明IGF-IR在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤组织中都呈现高表达。临床研究显示IGF-1R与经吉非替尼治疗的NSCLC患者较长存活显著相关。肿瘤患者检测IGF-1R mRNA表达水平，对临床上靶向药物的选择、用药量、靶向药物敏感性的确定及预后的判断有着重要的意义，同时提高靶向治疗的有效性，为患者争取更多宝贵的医治时间，大幅节省医治费用。 (4)靶向药物与血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR) 血管生成是人体肿瘤生长和转移的必要条件，抑制肿瘤细胞介导的血管生成已成为近年来寻找新型抗肿瘤药物的重要研究方向。血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)是血管生成抑制剂靶向治疗的主要靶标。血管生成抑制剂的药物作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞介导的血管生成来达到阻止肿瘤的生长、转移和复发的目的。目前FDA批准的此类药物包括舒尼替尼、索拉非尼和贝伐单抗等。 VEGFR家族的成员主要包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)，VEGFR1在血细胞生成过程中发挥重要作用，而VEGFR2在促有丝分裂、血管生成和VEGF渗透性效果的提高中起着主要调节作用。 临床研究已证实，VEGFR2可作为结肠癌病人使用5-FU或卡培他滨和奥沙利铂或贝伐单抗(FOLFOX/BV或XELOX/BV)联合治疗方案临床疗效独立的预测因子，其治疗疗效与VEGFR2基因表达水平密切相关，即VEGFR2基因表达水平高的患者的中位无进展生存期较长，而VEG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有：　　（１）与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括５’端的间隔臂序列和３’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列Ｐ１，所述支持探针选自ＳＥＱ．ＮＯ．１－ＳＥＱ．ＮＯ．１０，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；　　（２）连接支持探针与目标基因ｍＲＮＡ的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括５’端能与对应的目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列Ｐ２、间隔臂序列．ＮＯ．１５７中的５条或５条以上、和针对ＴＢＰ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．１５８－ＳＥＱ．ＮＯ．１６７中的５条或５条以上；所述Ｐ５为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４和总ｍＲＮＡ之间均不存在非特异性结合的序列。、３’端能与对应的支持探针的特异性序列Ｐ１互补配对的Ｐ３序列，所述支持延伸探针的特异性序列Ｐ２包括有：针对ＥＧＦＲ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．１１－ＳＥＱ．ＮＯ．１６中的２条或２条以上、针对ＫＩＴ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．１７－ＳＥＱ．ＮＯ．２２中的２条或２条以上、针对ＩＧＦ－１Ｒ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．２３－ＳＥＱ．ＮＯ．２８中的２条或２条以上、针对ＶＥＧＦＲ１基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．２９－ＳＥＱ．ＮＯ．３３中的２条或２条以上、针对ＶＥＧＦＲ２基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．３４－ＳＥＱ．ＮＯ．３８中的２条或２条以上、针对ＰＤＧＦＲＢ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．３９－ＳＥＱ．ＮＯ．４３中的２条或２条以上、和／或针对ＨＥＲ－２基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．４４－ＳＥＱ．ＮＯ．４８中的２条或２条以上；以及所述支持延伸探针的特异性序列Ｐ２还包括有：针对Ｂ２Ｍ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．４９－ＳＥＱ．ＮＯ．５３中的２条或２条以上、针对ＴＦＲＣ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．５４－ＳＥＱ．ＮＯ．５８中的２条或２条以上、和针对ＴＢＰ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．５９－ＳＥＱ．ＮＯ．６３中的２条或２条以上；　　（３）扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有５’端能与目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列Ｐ４、间隔臂序列、３’端序列Ｐ５，３’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列Ｐ４包括有：针对ＥＧＦＲ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．６４－ＳＥＱ．ＮＯ．７６中的５条或５条以上、针对ＫＩＴ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．７７－ＳＥＱ．ＮＯ．８６中的５条或５条以上、针...

【技术特征摘要】
1.一种受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对EGFR基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2条或2条以上、针对KIT基因的选自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中的2条或2条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ.NO.23-SEQ.NO.28中的2条或2条以上、针对VEGFR1基因的选自SEQ.NO.29-SEQ.NO.33中的2条或2条以上、针对VEGFR2基因的选自SEQ.NO.34-SEQ.NO.38中的2条或2条以上、针对PDGFRB基因的选自SEQ.NO.39-SEQ.NO.43中的2条或2条以上、和/或针对HER-2基因的选自SEQ.NO.44-SEQ.NO.48中的2条或2条以上；以及所述支持延伸探针的特异性序列P2还包括有针对B2M基因的选自SEQ.NO.49-SEQ.NO.53中的2条或2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ.NO.54-SEQ.NO.58中的2条或2条以上、和针对TBP基因的选自SEQ.NO.59-SEQ.NO.63中的2条或2条以上；(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有针对EGFR基因的选自SEQ.NO.64-SEQ.NO.76中的5条或5条以上、针对KIT基因的选自SEQ.NO.77-SEQ.NO.86中的5条或5条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ.NO.87-SEQ.NO.97中的5条或5条以上、针对VEGFR1基因的选自SEQ.NO.98-SEQ.NO.107中的5条或5条以上、针对VEGFR2基因的选自SEQ.NO.108-SEQ.NO.117中的5条或5条以上、针对PDGFRB基因的选自SEQ.NO.118-SEQ.NO.127中的5条或5条以上、针对HER-2基因的选自SEQ.NO.128-SEQ.NO.137中的5条或5条以上；以及所述扩增延伸探针的特异性序列P4还包括有针对B2M基因的选自SEQ.NO.138-SEQ.NO.147中的5条或5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ.NO.148-SEQ.NO.157中的5条或5条以上、和针对TBP基因的选自SEQ.NO.158-SEQ.NO.167中的5条或5条以上；所述P5为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。2.根据权利要求1所述的受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，还包括有填充序列，包括针对EGFR基因的SEQ.NO.168、针对KIT基因的SEQ.NO.169、针对IGF-1R基因的选自SEQ.NO.170-SEQ.NO.175中的1条或1条以上、针对VEGFR2基因的选自SEQ.NO.176-SEQ.NO.181中的1条或1条以上、针对PDGFRB基因的选自SEQ.NO.182-SEQ.NO.187中的1条或1条以上、针对HER-2基因的选自SEQ.NO.188-SEQ.NO.191中的1条或1条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.192-SEQ.NO.199中的1条或多条、和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.200-SEQ.NO.203中的1条或多条。3.根据权利要求1或2所述的受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。4.根据权利要求1所述的受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述P5的组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。5.一种受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对EGFR基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2条或2条以上、针对KIT基因的选自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，郭元杰，罗彩英，吴诗扬，杨惠夷，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]