用环状RNAcircKIF4A与miR-1231序列吸附量来检测细胞癌变程度制造技术

环状RNA circKIF4A序列与miR

【技术实现步骤摘要】
GCGTTACTGA
[0010]3901 AAAGAAGGTA ACCTTTGTTG GATGTGGGCC TTAGCCTCCA GGTCCAGACT ACTACTCTAT
[0011]3961 GTTCTCCAGA AGGGTGCTAA GTCACCTACT GAAGAGAGAA CCAACTGACT TTCCTATTGA
[0012]4021 CTCATCAGGA ACCAGTCCTC AGTCTGGTCA AGTTGTTTCT TATTTGTGAG CAGTTCAGGC
[0013]4081 TATCTCCTGA TGGGGATGAG GCCAAGGCTT TCTTATCTTT TGGTTGTCTC TGCTTAATGG
[0014]4141 AGGAGCCTGG CCTAGGATGG AGGCCTGGCT TAGATCTTTC ATTCCACCTC AGGAATGAGG
[0015]4201 TTGTGATCTT TCCTGTCCTG ACCCTCTCTG AATTATGTTT CAATAGTACT CTTGATTGTC
[0016]4261 TGCCATGTTG TTGAAGCAAA TGAATTATTT TTAAATGTTA AGTAAGTAAA TAAACCTTAG
[0017]4321 CCCGTCTACT GTTTGGGAAG ATCCTTCTGT GCTAGAGGGA GAAATAAAAT TTCAACCTGT
[0018]4381 GTTCCTCA
[0019]一种miR
‑
1231特定序列，其特征在于吸附环状RNA circKIF4A特定序列，环状RNA circKIF4A特定序列与miR
‑
1231特定序列见NO.2。如图3所示。
[0020]预测吸附位点举例如下，上方序列为环状RNA circKIF4A序列，下方为miR
‑
1231序列。但是通过生物信息分析，二者通过序列结合的位点不止此一种方式，还可能有其他序列结合位点：
[0021]circKIF4A特定序列：UGUUAAUAUUGAUCCCCAGACAG
[0022]miR
‑
1231特定序列：CGUCGACAGGCGGGUCUGUG
[0023]一种检测前列腺细胞癌变进程的方法，其特征在于，通过高通量检测、分析miR
‑
1231特定序列吸附环状RNA circKIF4A序列量，吸附数量越多则细胞癌变的程度越高。
[0024]所述的circKIF4A的m6A甲基化修饰程度越高，则吸附miR
‑
1231特定序列越多。我们通过高通量测序发现，在前列腺癌患者的癌细胞样本中这段序列的腺嘌呤脱氧核苷酸(A)发生了甲基化，
[0025]有益效果：通过高通量测序、分析环状RNA circKIF4A吸附miR
‑
1231特定序列或根据circKIF4A的m6A甲基化修饰程度可以判断细胞癌变程度，进而可以有效地针对性治疗。
附图说明
[0026]图1为表观转录组调控层面提示环状RNA抑制表达的miRNAs示意图。
[0027]图2为转录本NM_012310.5序列位于染色体位置及碱基序列
[0028]图3为：环状RNA circKIF4A特定序列与miR
‑
1231序列NO.2举例
具体实施方式
[0029]原理：通过非编码RNA高通量测序(illumina Novaseq平台，双端测序，PE150)，研究circKIF4A在前列腺癌癌细胞铁死亡的调控机制。技术路线如下：
[0030]1、通过铁死亡试剂盒，分析circKIF4A和miR
‑
1231对前列腺癌细胞铁死亡细胞程序性调控中枢抑制因子抗氧化酶GPX4的影响。GPX4在癌细胞铁死亡中的表达和活性依赖于谷胱甘肽和硒的存在。哺乳动物细胞和人细胞中已经证明存在以GPX4为核心的抑制细胞铁死亡的信号通路。
[0031]2、circKIF4A m6A修饰相关的表观遗传因子METTL16，上调circKIF4A的表达，增加对miR
‑
1231的吸附，进而影响miR
‑
1231的靶基因GPX4，上调铁死亡中枢抑制因子GPX4的表达，增加前列腺癌细胞铁死亡抑制作用，进而使前列腺癌超恶性方向发展。
[0032]具体实施例如下：
[0033](1)筛选Circular RNAs
[0034]通过RNA
‑
seq高通量测序分析在前列腺癌癌组织中异常表达的circRNAs,在本研究中，根据生物信息分析选择circKIF4A
[0035]1.在30对临床前列腺癌组织及其配对癌旁组织中，进行生物学重复的全转录组的RNA
‑
seq分析(包括circRNAs建库)，通过RNA
‑
seq分析筛选出在前列腺癌组织中高表达的circRNAs,通过qPCR在前列腺癌细胞中对筛选到的Circular RNAs进行验证，通过综合分析，选择circKIF4A。
[0036]2.在正常前列腺细胞或多种前列腺癌细胞系中，通过qPCR实验分析的circKIF4A。表达，寻找两个circKIF4A表达较高的前列腺癌细胞系，用于后续分析，在此先以PC3 and C4
‑
2细胞为例。
[0037]3.分别合成circKIF4A，及其同转录本的mRNA的PCR引物，在PC3 and C4
‑
2细胞中，利用qPCR实验验证及其同转录本的mRNA对RNase R和放线菌铜D的敏感性，以分析circKIF4A的稳定特性。
[0038]4.在PC3 and C4
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2细胞中，利用qPCR技术，以GAPDH为内参，分析验证circKIF4A在细胞中的表达。
[0039]5.利用qPCR实验，在PC3 and C4
‑
2细胞中，从多个shRNAs中筛选出效率最高的shRNA，用于后续实验。
[0040](2)研究circKIF4A对前列腺癌肿瘤细胞铁死亡的影响
[0041]通过靶向免疫沉淀、铁死亡试剂盒等细胞生物学、分子生物学和生物化学手段，分析circKIF4A对肿瘤细胞铁死亡的影响。
[0042]1.在PC3 and C4
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2细胞中，利用circKIF4A shRNAs，通过不同的试剂盒，分析Circular RNA A对iron,lipid ROS,Fe
2+
,MDA,GSH等铁死亡标志物的影响。
[0043]2.在PC3 and C4
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2细胞中，利用circKIF4A shRNAs，通过Western blot以及免疫荧光实验，分析circKIF4A对ACSL4、GP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA circKIF4A序列，其特征在于，序列转录本见NM_012310.5。2.一种miR
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1231特定序列，其特征在于吸附权利要求1中特定的序列，circKIF4A序列与miR
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1231特定序列见NO.2。3.一种检测前列腺细胞癌变进程的方法，其特征在于，通过高通量测序检测、生物信息分析环状RNA c...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆海东，汪宁梅，张文参，
申请(专利权)人：上海裕隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：