一种用于提高基因敲除效率的方法技术

一种用于提高基因敲除效率的方法，本发明专利技术涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。本发明专利技术的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，本发明专利技术针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围使用多个高效sgRNA(约3

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高基因敲除效率的方法


[0001]本专利技术涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。

技术介绍

[0002]相对于传统的ZFN(zinc
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finger nucleases)和TALEN(transcription activator
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like effector nucleases)基因编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，由于它的高效便捷的优势，目前已在众多基因治疗和生命科学研究中扮演者重要的角色。而现有的CRISPR/Cas9除了存在脱靶效应和sgRNA靶向位置依赖基因组中的PAM位点外，还有基因敲除效率不高等问题。如果敲除效率低会导致基因敲除后的细胞基因改变频率低，只有极少的细胞发生了基因敲除。对于细胞群体而言等于没有明显的细胞功能变化，从而对于细胞功能的研究和细胞的功能改变大大降低。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，提供一种用于提高基因敲除效率的方法。
[0004]本专利技术一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：
[0005]一、针对目的基因序列片段设计5
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15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5
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15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h
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48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
[0006]二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3
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6个sgRNA；
[0007]三、将步骤二选出的3
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6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
[0008]四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
[0009]五、目的细胞培养24
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48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
[0010]本专利技术的有益效果为：
[0011]本专利技术针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围设计多个高效sgRNA(3
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6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。基因编辑效率的高低与所使用的sgRNA具有显著相关性。单个sgRNA的基因敲除效率是固定且有限的。同时导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。
附图说明
[0012]图1为NCBI检索图；
[0013]图2为PCR引物和sgRNA设计的示意图。
具体实施方式
[0014]具体实施方式一：本实施方式一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：
[0015]一、针对目的基因序列片段设计5
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15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5
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15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h
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48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
[0016]二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3
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6个sgRNA；
[0017]三、将步骤二选出的3
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6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
[0018]四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
[0019]五、目的细胞培养24
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48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
[0020]本实施方式的有益效果为：本实施方式针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围设计多个高效sgRNA(3
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6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。基因编辑效率的高低与所使用的sgRNA具有显著相关性。单个sgRNA的基因敲除效率是固定且有限的。同时导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。
[0021]具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：目的基因序列片段为目的基因位点前50bp
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目的基因位点后50bp。其他与具体实施方式一相同。
[0022]具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：目的基因序列片段为BCL11A基因第58号增强子序列。其他与具体实施方式一至三之一相同。
[0023]具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中合成sgRNA的方法为体外制备。其他与具体实施方式一至三之一相同。
[0024]具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：体外制备sgRNA的方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化sgRNA。其他与具体实施方式一至四之一相同。本实施方式中的sgRNA体外转录试剂盒为赛默飞的Precision gRNA Synthesis Kit(货号：A29377)。
[0025]具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中合成sgRNA的方法为化学合成。其他与具体实施方式一至五之一相同。
[0026]具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中将多个Cas9/sgRNA蛋白复合物按照等体积、等浓度混合。其他与具体实施方式一至六之一相同。
[0027]为验证本专利技术的有益效果进行了以下实验：
[0028]实施例：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对患者自体核移植胚胎干细胞的BCL11A的+58红系增强子序列进行基因敲除：
[0029]背景概述：人体内有三种携带氧气的蛋白，有肌红蛋白，胎红蛋白，血红蛋白。胎红蛋白的氧结合能力比血红蛋白要强，它只在婴儿时期大量表达，方便婴儿通过胎盘从母体里面获得更多的氧气。当婴儿长大到一岁后，人体内基因调控开始进行，胎红蛋白表达受到抑制，血红蛋白开始大量表达。因为血红蛋白的氧运输能力更强，所以更利于成人的正常生
活。而β地贫患者或镰刀状细胞贫血症患者，他的血红蛋白的基因发生了变异，导致氧运输能力出现异常，从而引发各种并发症。我们的思路就是利用基因编辑技术重新开放患者的胎红蛋白的表达。通过最近研究发现，形成胎红蛋白的γ蛋白被BCL11A基因抑制了，研究者对BCL11A基因进行了大量实验研究，证实了作为转录抑制因子的BCL11A对胎儿血红蛋白(Hb F)的表达有直接负性调控作用，尤其是抑制Hb F的表达。虽然BCL11A基因的结构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、针对目的基因序列片段设计5
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15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5
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15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h
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48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3
‑
6个sgRNA；三、将步骤二选出的3
‑
6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；五、目的细胞培养24
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48h小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小方，孔明圣，门增轩，
申请(专利权)人：珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：