一种外泌体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体的制备方法，其中，所述制备方法包括：使用

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的制备方法


[0001]本专利技术属于干细胞
，尤其涉及一种外泌体的制备方法
。

技术介绍

[0002]间充质干细胞
(MSC)
是再生医学领域应用最广泛的干细胞，它们不仅具有进行多次细胞分裂的自我更新能力，而且还通过与一系列免疫细胞的直接相互作用发挥抗炎和免疫抑制特性
。
间充质干细胞作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，间充质干细胞用于治疗免疫排斥和自身免疫性疾病
。
目前间充质干细胞主要来源于成体间充质干细胞，包括骨髓
、
脐带
、
胎盘
、
脂肪组织等，其稳定性和一致性受组织供者差异性影响，较难得到控制和保障
。
成体间充质干细胞的异质性问题也会影响下游间充质干细胞的外泌体
、
分泌蛋白等衍生物的一致性问题
。
[0003]外泌体是具备纳米颗粒结构的，直径为
30
‑
150nm
的细胞外囊泡，是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的膜性囊泡
。
间充质干细胞是治疗性外泌体的最佳来源，大量研究表明，
MSC
来源外泌体表现出与
MSCs
相似的功能
(
例如，修复受损组织
、
调节免疫反应和发挥抗炎作用
)
，在临床上，干细胞外泌体主要治疗烧伤
、
烫伤
、
皮肤溃疡，再生健康皮肤；在护肤方面，主要是对外伤受损
、
衰老皮肤进行修复，全面调理皮肤
、
改善肤质，令肌肤恢复年轻
、
健康的状态
。
与间充质干细胞相比，外泌体更便于储存和运输
。
此外，它们避免了与细胞移植相关的许多风险
。
在自身免疫性疾病的治疗中，
MSC
外泌体作为无细胞治疗的载体受到了广泛的关注，因为它们不仅承载了
MSC
本身的大部分治疗作用，而且减少了人们对注射活细胞安全性的担忧
。MSC
外泌体在临床治疗上较
MSCs
具有显著优势，未来可能完全替代
MSCs
治疗
。
[0004]目前的外泌体制备方法对实验室设备要求高，重复性差，耗时长，容易对外泌体的结构造成破坏，这些都限制了间充质样干细胞外泌体的大规模提取的发展
。
因此，急需高产量
、
高质量
、
高稳定性的外泌体制备方法
。

技术实现思路

[0005]为了克服现有的制备外泌体质量较低
、
产量低
、
成本高
、
耗时长和重复性差的缺陷，以及满足大规模生产的需求，本专利技术提供了一种外泌体的制备方法
。
本专利技术所述的外泌体的制备方法达到了外泌体质量较佳
、
产量高
、
成本低
、
耗时短和重复性强的效果，可更好地实现外泌体的大规模产业化
。
[0006]本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题：
[0007]本专利技术的一方面提供了一种间充质样干细胞的制备方法，所述制备方法包括：
[0008]a.
使用
CORNING
多层细胞培养皿培养人胚胎干细胞分化得到的间充质样干细胞；所述间充质样干细胞的培养密度为
1000
细胞数
/cm2，所述间充质样干细胞的培养条件为5％
CO2，
37℃
；
[0009]b.
收集细胞上清；
[0010]c.
收获外泌体
。
[0011]较佳地，所述间充质样干细胞为人胚胎干细胞
(hES)
经滋养层细胞分化得到的间充质样干细胞
T
‑
MSC(Mesenchymal Stem Cell derived from hESCs via a Trophoblast intermediate stage)。
优选地，
T
‑
MSC
为专利
CN104487568B
所述的
T
‑
MSC。
[0012]专利
CN104487568B
提供了一种从人胚胎干细胞
(hESCs)
或诱导多能干细胞生产滋养层来源的间充质干细胞
(T
‑
MSCs)
的方法，所述方法包括：
[0013](a)
在包含骨形态发生蛋白
4(BMP4)
的培养基中培养
hESCs
或
iPSCs2
‑5天，足以使
hESCs
或
iPSCs
分化成滋养层；
[0014](b)
把滋养层细胞分散成单细胞；
[0015](c)
将所述滋养层细胞重新铺在包被明胶
、
玻连蛋白
、
层粘连蛋白
、
纤连蛋白
、
基质胶或胶原的板上；以及
[0016](d)
在包含
20
％
FBS
和非必需氨基酸的
α
‑
MEM
的间充质干细胞
(MSC)
生长培养基中培养所述滋养层细胞4‑
10
天，所述培养基的量足够诱导所述滋养层细胞分化成间充质干细胞
。
[0017]较佳地，所述制备方法还包括收集细胞上清后对所述细胞上清除杂
。
[0018]更佳地，所述除杂为离心除杂
。
[0019]进一步较佳地，所述离心除杂为梯度离心
。
优选地，所述梯度离心的条件为
400
‑
600g
离心5‑
8min。
更优选地，所述梯度离心的条件为
400
‑
600g
离心5‑
8min
，取上清液再
1500
‑
2000g
离心
25
‑
30min。
进一步优选地，所述梯度离心的条件为
500g
离心
5min
，取上清液再
2000g
离心
30min。
[0020]较佳地，所述收获外泌体的步骤包括将细胞上清与
PEG
溶液
(
聚乙二醇溶液
)
混合，得到混合的溶液；所述
PEG
溶液中包含的
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
a.
使用
CORNING
多层细胞培养皿培养人胚胎干细胞分化得到的间充质样干细胞；所述间充质样干细胞的培养密度为
1000
细胞数
/cm2，所述间充质样干细胞的培养条件为5％
CO2，
37℃
；
b.
收集细胞上清；
c.
收获外泌体
。2.
如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质样干细胞为
T
‑
MSC
，优选为如专利
CN104487568B
所述的
T
‑
MSC。3.
如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括收集细胞上清后对所述细胞上清除杂；优选地，所述除杂为离心除杂；更优选地，所述离心除杂为梯度离心
。4.
如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心的条件为
400
‑
600g
离心5‑
8min
；优选地，所述梯度离心的条件为
400
‑
600g
离心5‑
8min
，取上清液再
1500
‑
2000g
离心
25
‑
30min
；更优选地，所述梯度离心的条件为
500g
离心
5min
，取上清液再
2000g
离心
30min。5.
如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述收获外泌体的步骤包括将细胞上清与
PEG
溶液混合，得到混合的溶液；所述
PEG
溶液中包含的
PEG
为
PEG2000
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：何裕笙，陈连快，王小方，
申请(专利权)人：珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：