一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用

【技术实现步骤摘要】
一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用
。

技术介绍

[0002]线粒体是负责维持能量代谢
、
产生细胞所需的三磷酸腺苷（
ATP
）等重要功能的细胞器
。
研究表明，线粒体功能障碍与多种疾病的发生和发展密切相关，如线粒体脑肌病
、
神经退行性疾病（如帕金森病
、
阿尔茨海默病）
、
心血管疾病
、
肿瘤和代谢性疾病等
。
线粒体功能障碍在这些疾病的发病机制中起着重要作用，如线粒体呼吸链功能障碍和活性氧生成增加可导致氧化应激，进而对机体细胞
、
组织和器官产生损害，导致疾病的发生发展
。
[0003]线粒体在创面愈合过程中也发挥着不可或缺的作用
。
近期研究表明，细胞代谢中线粒体功能变化是伤口愈合过程中巨噬细胞效应功能的关键调控机制
。
线粒体功能障碍，
mtROS
增加会使炎症期中性粒细胞长期浸润，延缓巨噬细胞募集，影响肉芽增生及血管化的形成
。
如Ⅱ型糖尿病患者线粒体功能障碍，活性氧的生成增加和
ATP
合成减少；辐射对线粒体大分子和电子传递链造成损伤，初级和次级活性氧的产生增加，均可导致创面愈合时间延长
。
[0004]近年来，有许多关于线粒体功能障碍的治疗方法
。
例如通过药物可以改善线粒体功能，如辅酶
Q10、
可溶性鸟苷酸环化酶
、NAD+
增强剂等；通过线粒体转移方式，将健康的线粒体转移至体内，替代功能异常的线粒体，进行代谢重编程，从而改善代谢障碍
。
但高
Ca
2+
浓度（大于
2.0mM
）的细胞外环境和氧化应激可能损害注入局部组织的外源性线粒体的活力，从而影响游离线粒体移植的治疗效果
。
近期的研究表明也通过细胞外囊泡转移线粒体改善能量代谢障碍，从而治疗小鼠的急性肺损伤及心肌梗死
。
因细胞外囊泡的脂质双分子层阻止了
Ca
2+
扩散，避免线粒体和相关内容物受到损害
。
因此，通过细胞外囊泡转移线粒体进行代谢重编程，从而改善巨噬细胞能量代谢障碍，促进慢性创面愈合，是一种可行性较强的治疗方法
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的为促进难愈性伤口愈合
。
[0006]本专利技术首先保护一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的制备方法，可包括步骤（1）：用二甲双胍诱导培养脂肪间充质干细胞
。
[0007]上述制备方法中，所述二甲双胍诱导培养的条件为：用浓度为
50
‑
100
μ
M
（如
50
‑
75
μ
M、75
‑
100
μ
M、5
μ
M、75
μ
M
或
100
μ
M
）的二甲双胍诱导培养
20
‑
60h
（如
20
‑
40h、40
‑
48h、48
‑
60h、20h、40h、48h
或
60h
）
。
[0008]上述制备方法中，所述脂肪间充质干细胞可通过商业途径购买获得，也可通过从脂肪组织（一般为新鲜皮下脂肪组织）中提取获得
。
[0009]上述制备方法中，诱导培养时，所述脂肪间充质干细胞的细胞融合度可达到
70
‑
80%。
[0010]上述任一所述的制备方法还可包括步骤（2）和（3）：（2）完成步骤（1）后，清洗并将培养基更换为含去外泌体的血清培养基，继续培养
20
‑
60h
（如
20
‑
40h、40
‑
48h、48
‑
60h、20h、40h、48h
或
60h
）；（3）完成步骤（2）后，去除悬浮细胞
、
凋亡小体和细胞碎片，之后清洗，得到富含活性线粒体的细胞外微囊泡
。
[0011]所述步骤（2）中，所述清洗可为用
PBS
缓冲液清洗1次以上（如2次
、3
次
、4
次）
。
[0012]所述步骤（2）中，所述含去外泌体的血清培养基可为含5‑
15%
（如5‑
10%、10
‑
15%、5%、10%
或
15%
）去外泌体的血清培养基
。
所述血清培养基可为
EXO
‑
free
血清培养基（赛业生物
OriCell
®
，
CAT#HUXMD
‑
90012
）
。
[0013]所述步骤（3）中，去除悬浮细胞
、
凋亡小体和细胞碎片通过离心实现
。
具体的，首先
4℃、300g
离心
5min
，收集上清（目的为去除悬浮细胞）
。
之后，继续
4℃、2000g
离心
10min
，收集上清（目的为去除凋亡小体及细胞碎片）
。
[0014]所述步骤（3）中，所述清洗可为用
PBS
缓冲液清洗1次以上（如2次
、3
次
、4
次）
。
[0015]上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡也属于本专利技术的保护范围
。
[0016]本专利技术还保护一种负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备方法，可包括如下步骤：（
a1
）将脂肪组织脱细胞基质凝胶
、
甲基丙烯化透明质酸凝胶和上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡混匀，得到预凝胶溶液；（
a2
）将预凝胶溶液加入微针模具，凝胶化后脱模，得到负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片
。
[0017]上述制备方法中，所述甲基丙烯化透明质酸凝胶的浓度可为
6%
以上（如
6%
‑
10%、6%
‑
8%、8%
‑
10%、6%、8%
或
10%
）
。
所述甲基丙烯化透明质酸凝胶的浓度优选为
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的制备方法，包括步骤（1）：用二甲双胍诱导培养脂肪间充质干细胞
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述二甲双胍诱导培养的条件为：用浓度为
50
‑
100
μ
M
的二甲双胍诱导培养
20
‑
60h。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括步骤（2）和（3）：（2）完成步骤（1）后，清洗并将培养基更换为含去外泌体的血清培养基，继续培养
20
‑
60h
；（3）完成步骤（2）后，去除悬浮细胞
、
凋亡小体和细胞碎片，之后清洗，得到富含活性线粒体的细胞外微囊泡
。4.
采用权利要求1至3任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡
。5.
一种负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备方法，包括如下步骤：（
a1
）将脂肪组织脱细胞基质凝胶
、
甲基丙烯化透明质酸凝胶和权利要求1至3任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡混匀，得到预凝胶溶液；（
a2
）将预凝胶溶液加入微针模具，凝胶化后脱模，得到负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片
。6.
根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周军年，裴雪涛，岳文，姚文德，习佳飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：