利用二次组织贴壁获得脐带间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术属于间质干细胞培养领域，具体涉及利用二次组织贴壁获得脐带间充质干细胞的方法

【技术实现步骤摘要】
利用二次组织贴壁获得脐带间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于间质干细胞培养领域，具体涉及利用二次组织贴壁获得脐带间充质干细胞的方法
。

技术介绍

[0002]脐带间充质干细胞，是从脐带中分离出来的一种成体干细胞，因其来源广泛
、
取材方便
、
免疫原性弱
、
增殖能力强的优势被广泛的应用于临床研究
。
可在微环境作用下归巢到损伤部位并分化为特异的组织细胞，分泌大量活性物质，具有创伤修复
、
免疫调节能力，有效的回避了胚胎干细胞涉及的伦理问题，也避免了类似诱导多能干细胞因复杂的诱导转分化机制所带来的安全性和风险问题，成为最具潜力的种子细胞
。
[0003]脐带由2条脐动脉和1条脐静脉构成，是连接胎盘和胎儿的管状结构，脐带的羊膜和血管间含有丰富的由蛋白多糖及各种胶原蛋白组成的凝胶状结缔组织，被称为华通氏胶，脐带华通氏胶中富含的基质细胞即脐带间充质干细胞
。
[0004]目前分离脐带来源的间充质干细胞主要有组织块贴壁法和酶消化法
。
酶消化法获得的细胞纯度略低
、
状态不均一
、
部分可能因消化酶的损伤无法贴壁生长；组织贴壁培养法得到的细胞纯度较高，对细胞伤害小，操作相对简单，将组织块剪碎
、
贴壁后加培养基培养即可，但原代培养主要存在以下缺点：
①
培养周期长，补液操作过程耗时2～4周，且细胞集落出现缓慢，并集中出现在培养瓶周围；
②
对华通氏胶的培养效率低，获得
P0
代种子细胞少，华通氏胶只能经过一次培养，且仅能培养华通氏胶的一面，可激发出的细胞集落少
。
因此开发一种周期短
、
培养效率高的脐带间充质干的细胞培养方法尤为重要
。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供利用二次组织贴壁获得脐带间充质干细胞的方法
。
[0006]本专利技术提供了脐带间充质干细胞的培养方法，其为：获取的华通氏胶组织块经第一培养
、
重接种
、
第一补液
、
第一换液后，待细胞集落平均汇合度大于
80
％，收集获得脐带间充质干细胞；
[0007]所述重接种的时间为培养的第3～6天
。
[0008]本专利技术所述的培养方法中，
[0009]华通氏胶第一培养的密度为
1.875g/10ml
～
6.25g/10ml
；在本专利技术的一些具体的实施例中，将3～
5g
华通氏胶组织块接种进入
T175
培养瓶后加入
8ml
～
16ml
的培养基，所述培养基为完全培养基
。
[0010]华通氏胶第一培养的条件为
CO2浓度
5.0
％
、
温度
37.0℃。
[0011]第一补液为补充完全培养基，补液量为
10
～
15ml/T175
培养瓶；所述完全培养基为含有
10vol
％胎牛血清的基础培养基；所述基础培养基包括
DMEM
基础培养基
、
α
‑
MEM
基础培养基和
/
或
DMEM/F12
基础培养基中的至少一种
。
[0012]第一换液为更换全部完全培养基，所述完全培养基为含有
10vol
％胎牛血清的基础培养基；所述基础培养基包括
DMEM
基础培养基
、
α
‑
MEM
基础培养基和
/
或
DMEM/F12
基础培养基中的至少一种
。
[0013]停止第一补液的标准为细胞平均汇合度大于
75
％；
[0014]停止第一换液的标准为细胞平均汇合度大于
75
％
。
[0015]进一步的，本专利技术所述的培养方法，
[0016]所述第一补液后和第一换液前还包括去除华通氏胶
、
被去除华通氏胶的冻存
、
复苏和第二补液的步骤
。
[0017]所述华通氏胶冻存的密度为
0.1g/ml
～
0.5g/ml
；
[0018]所述冻存的冻存液包括
10vol
％
DMSO
和
90vol
％
FBS
；
[0019]所述冻存的时间为4～
12
周；
[0020]所述复苏的条件为
37℃
水浴
。
[0021]本专利技术对常规的华通氏胶培养方法进行了改进，增加了重接种的步骤，实验结果表明，重接种后的细胞培养周期缩短且细胞单位密度增大；将重接种后的华通氏胶经换液培养后进行冻存，然后复苏，再按照本专利技术所述培养方法进行培养，结果表明，重接种冻存的华通氏胶经本专利技术所述培养方法培养后的细胞周期更短，细胞单位密度更大
。
更换培养条件
、
步骤或试剂，培养华通氏胶获得的脐带间充质干细胞分化潜能降低或消失
。
[0022]更进一步的，本专利技术所述的培养方法，所述收集获得脐带间充质干细胞后还包括清洗
、
消化
、
终止消化和重悬的步骤；
[0023]所述清洗的试剂为
0.9wt
％氯化钠溶液；
[0024]所述消化为利用重组胰蛋白酶消化；
[0025]所述重组胰蛋白酶的浓度为：
0.01mg/ml
～
0.2mg/ml
；
[0026]所述重组胰蛋白酶的用量为：
30
～
50
μ
l/cm2；
[0027]所述消化的条件为室温消化4～6分钟
。
[0028]所述终止消化的溶液为完全培养基；所述完全培养基为含有
10vol
％胎牛血清的基础培养基；所述基础培养基包括
DMEM
基础培养基
、
α
‑
MEM
基础培养基和
/
或
DMEM/F12
基础培养基中的至少一种
。
[0029]本专利技术提供了华通氏胶高密度快速培养方法，其中包括对冻存华通氏胶的复苏培养；本专利技术的华通氏胶转移培养方法中对华通氏胶进行了重接种，以及对冻存华通氏胶的复苏培养中也增加了重接种的步骤，结果表明，与其他方法相比，重接种后华通氏胶培养周期缩短且收获细胞单位密度增大，证明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
脐带间充质干细胞的培养方法，其为：获取的华通氏胶组织块经第一培养
、
重接种
、
第一补液
、
第一换液后，待细胞集落平均汇合度大于
80
％，收集获得脐带间充质干细胞；所述重接种的时间为培养的第3～6天
。2.
根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，华通氏胶第一培养的密度为
1.875g/10ml
～
6.25g/10ml
；华通氏胶第一培养的条件为
CO2浓度
5.0
％
、
温度
37.0℃。3.
根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述第一补液为补充完全培养基；所述完全培养基为含有
10vol
％胎牛血清的基础培养基；所述基础培养基包括
DMEM
基础培养基
、
α
‑
MEM
基础培养基和
/
或
DMEM/F12
基础培养基中的至少一种
。4.
根据权利要求1～3任一项所述的培养方法，其特征在于，所述第一换液为更换全部完全培养基，所述完全培养基为含有
10vol
％胎牛血清的基础培养基；所述基础培养基包括
DMEM
基础培养基
、
α
‑
MEM
基础培养基和
/
或
DMEM/F12
基础培养基中的至少一种
。5.
根据权利要求1～4任一项所述的培养方法，其特征在于，停止第一补液的标准为细胞平均汇合度大于
75
％；停止第一换液的标准为细胞平均汇合度大于
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，黄幸，罗二梅，林丹锐，
申请(专利权)人：广东省赛莱拉干细胞研究院广东国科细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：