一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其包括包括以下步骤：S1、获取间充质干细胞悬液；S2、将海藻酸钠溶液加入所述间充质干细胞悬液中，得到细胞混合液；S3、将所述细胞混合液滴入含有CaCl2溶液的细胞培养瓶中，得到若干成型的3D水凝胶微球；S4、利用去交联液破碎3D水凝胶微球，释放间充质干细胞。通过本发明专利技术的3D水凝胶微球负载间充质干细胞培养法，给间充质干细胞提供3D方向生长环境，并且3D水凝胶微球可以悬浮在培养基中，避免了培养皿底面积对细胞密度的限制；2、3D水凝胶微球培养法能模拟间充质干细胞体内生长条件，且细胞增殖率显著高于传统2D培养。胞增殖率显著高于传统2D培养。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法。

技术介绍

[0002]利用间充质干细胞(UC
‑
MSCs)大量体外培养及其细胞产物的获取目前研究热点，生产过程中往往需要大量获取间充质干细胞，而间充质干细胞是一种贴壁细胞，需要采用贴壁培养的方法进行培养，细胞贴壁培养受培养皿限制，因此间充质干细胞数量受培养器皿有效生长面积的限制，不利于大规模制备。而且2D培养法并不能模拟间充质干细胞体内生长条件。

技术实现思路

[0003]针对上述现有2D培养法并不能模拟间充质干细胞体内生长条件的问题，本专利技术提供使用3D水凝胶微球模拟间细胞体内生理环境培养间充质干细胞的一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法。
[0004]一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，包括以下步骤：
[0005]S1、获取间充质干细胞悬液；
[0006]S2、将海藻酸钠溶液加入所述间充质干细胞悬液中，得到细胞混合液；
[0007]S3、将所述细胞混合液滴入含有CaCl2溶液的细胞培养瓶中，得到若干成型的3D水凝胶微球。
[0008]S4、利用去交联液破碎3D水凝胶微球，释放间充质干细胞。
[0009]进一步的，所述步骤S1包括：
[0010]S101、将原代的间充质干细胞在细胞培养皿中培养至80％
‑
90％融合后进行传代培养；
[0011]S102、待传代的培养的间充质干细胞90
‑
95％融合后，无动物血清来源的重组酶TrypLE消化间充质干细胞，加入PBS稀释消化液，500
×
g下离心5min,去除上清液后，收集传代的间充质干细胞并重悬于间充质干细胞专用的无血清培养基中，得到间充质干细胞悬液。
[0012]进一步的，所述步骤S2包括：
[0013]S201、将所述间充质干细胞悬液的细胞浓度调整为2
×
106个/mL；
[0014]S202、将所述海藻酸钠溶液通过水浴锅孵育至37℃后，转移至细胞培养生物安全柜中；
[0015]S203、在细胞培养生物安全柜中加入与所述海藻酸钠溶液等体积的所述间充质干细胞悬液，得到细胞混合液。
[0016]进一步的，所述步骤S3包括：
[0017]S301、将所述细胞混合液装入20mL注射器中，去掉针头，然后将所述细胞混合液逐
滴滴入含有CaCl2溶液的细胞培养瓶中，得到若干成型的3D水凝胶微球；
[0018]S302、将所述3D水凝胶微球与CaCl2分离，用PBS润洗3D水凝胶微球2次，然后用间充质干细胞培养基润洗3D水凝胶微球1次，加入新鲜的间充质干细胞培养基，置于细胞培养箱中37℃，5％CO2条件下培养。
[0019]进一步的，所述步骤S4包括：
[0020]S401、培养8天后，将所述3D水凝胶微球与培养基分离，D
‑
PBS润洗3次，然后加入去交联液，37℃水浴5min，然后使用移液枪吹打，破碎3D水凝胶微球，得到水凝胶碎片与去交联液的混合液；
[0021]S402、将所述混合液置于离心管中，500
×
g下离心5min,去除上清液后，收集沉淀物1；
[0022]S403、向所述沉淀物1中加入无动物血清来源的重组酶TrypLE，37℃水浴5min，然后于500
×
g下离心5min,去除上清液后，收集沉淀物2；
[0023]S404、向所述沉淀物2中加入D
‑
PBS溶液，然后于500
×
g下离心5min,去除上清液后，收集沉淀物3；
[0024]D405、将所述沉淀物3重悬于D
‑
PBS溶液中，200目细胞筛过滤，得到滤过的细胞悬液。
[0025]进一步的，所述步骤S202中所述海藻酸钠溶液中的海藻酸钠占比为2％。
[0026]进一步的，所述细胞浓度调整为1
×
106个/mL；
[0027]进一步的，所述步骤S3中所述CaCl2溶液中的CaCl2占比为2％。
[0028]进一步的，所述步骤S3中所述3D水凝胶微球的直径为3mm
‑
3.5mm。
[0029]进一步的，所述步骤S3中每个所述3D水凝胶微球中含4
×
104‑5×
104个所述间充质干细胞。
[0030]进一步的，所述步骤S401中所述去交联液，配方为：3％的柠檬酸钠，1％的柠檬酸，溶剂为D
‑
PBS。
[0031]相比于现有技术，本专利技术的优点及有益效果在于：3D水凝胶微球培养法相比常规2D培养的优点有：1、间充质干细胞为贴壁细胞，细胞贴壁培养受培养皿限制，因此间充质干细胞细胞密度受培养器皿底面积的限制，但3D水凝胶微球培养可以负载间充质干细胞，给间充质干细胞提供3D方向生长环境，并且3D水凝胶微球可以悬浮在培养基中，避免了培养皿底面积对细胞密度的限制。2、体内细胞生长在一个3D的生长环境，而贴壁培养法给细胞提供的是2D的生长环境，并不能模拟间充质干细胞体内生长条件，而3D水凝胶微球培养法可以模拟体内3D环境。3、3D水凝胶微球培养法可以促进间充质干细胞增殖，增殖率显著高于传统2D培养。
附图说明
[0032]图1为本专利技术的流程示意图；
[0033]图2为本专利技术中实施例的流程示意图；
[0034]图3为海藻酸钠水凝胶3D球体中间充质干细胞分布图(黑色箭头指示细胞)；
[0035]图4为间充质干细胞在1mm
‑
1.5mm和3mm
‑
3.5mm两种不同直径海藻酸钠水凝胶中增殖情况；
[0036]图5为不同放大倍率下扫描电镜下海藻酸钠水凝胶表面结构及间充质干细胞形态示意图；
[0037]图6为间充质干细胞标志物基因表达在1mm
‑
1.5mm和3mm
‑
3.5mm两种不同直径海藻酸钠水凝胶中的变化示意图；
[0038]图7为细胞培养瓶中悬浮的3
‑
3.5mm直径3D水凝胶微球示意图；
具体实施方式
[0039]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0040]如图1
‑
2所示，实施例：
[0041]步骤S1：
[0042]将原代的间充质干细胞细胞继续培养至80
‑
90％融合后进行传代培养。在4℃下用D
‑
PBS缓冲液中吸水溶胀，静置12h后，70℃水浴20min，反复进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获取间充质干细胞悬液；S2、将海藻酸钠溶液加入所述间充质干细胞悬液中，得到细胞混合液；S3、将所述细胞混合液滴入含有CaCl2溶液的细胞培养瓶中，得到若干成型的3D水凝胶微球。S4、利用去交联液破碎所述3D水凝胶微球，释放间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其特征在于，所述步骤S1包括：S101、将原代的间充质干细胞在细胞培养皿中培养至80％
‑
90％融合后进行传代培养；S102、待传代的培养的间充质干细胞90
‑
95％融合后，无动物血清来源的重组酶TrypLE消化间充质干细胞，加入PBS稀释消化液，500
×
g下离心5min,去除上清液后，收集传代的间充质干细胞并重悬于间充质干细胞专用的无血清培养基中，得到间充质干细胞悬液。3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其特征在于，所述步骤S2包括：S201、将所述间充质干细胞悬液的细胞浓度调整为2
×
106个/mL；S202、将所述海藻酸钠溶液通过水浴锅孵育至37℃后，转移至细胞培养生物安全柜中；S203、在细胞培养生物安全柜中加入与所述海藻酸钠溶液等体积的所述间充质干细胞悬液，得到细胞混合液。4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其特征在于，所述步骤S3包括：S301、将所述细胞混合液装入20mL注射器中，去掉针头，然后将所述细胞混合液逐滴滴入含有CaCl2溶液的细胞培养瓶中，得到若干成型的3D水凝胶微球；S302、将所述3D水凝胶微球与CaCl2分离，用PBS润洗3D水凝胶微球2次，然后用间充质干细胞培养基润洗3D水凝胶微球1次，加入新鲜的间充质干细胞培养基，置于细胞培养箱中37℃，5％CO2条件下培养。5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的3D水凝胶微球悬浮培养及分离回收方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：高力扬，周晓宇，张扬，李陶，张立忠，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：