一种从胎盘分离间充质干细胞的方法及相应的间充质干细胞来源组织的保存方法技术

本发明专利技术公开了一种从胎盘分离间充质干细胞的方法及相应的间充质干细胞来源组织的保存方法；所述方法包括以下步骤：在胎盘组织中加入含胶原蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种从胎盘分离间充质干细胞的方法及相应的间充质干细胞来源组织的保存方法


[0001]本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种从胎盘分离间充质干细胞的方法及相应的间充质干细胞来源组织的保存方法
。

技术介绍

[0002]间充质干细胞
(mesenchymalstem cells
，
or mesenchymal stromal cells
，
MSC)
是一种具有多向分化能力的成体干细胞，广泛存在于身体的多种组织，能够分化形成多种组织细胞，并通过分泌大量细胞因子，参与构成组织再生微环境，促进组织损伤修复，调节机体免疫反应
。MSC
可来源于脐带
、
胎盘
、
骨髓
、
脂肪等
。
胎盘属于“医疗废弃”组织，满足伦理要求，同时具有单一组织量大，组织年轻
、MSC
含量比较丰富
、
组织来源丰富等优点，是开展
MSC
规模化制备进行成药研究的理想组织来源
。
[0003]从胎盘中分离
MSC
的方法主要有酶解法
、
组织贴壁法
。
酶解法是将组织小块进行酶消化，获得单细胞悬液，从中分离
MSC
；此方法存在的不足是，致密组织难以被酶解，长时间消化对细胞损伤大，影响细胞的存活及生物学特性；而对组织过度机械切割也会影响组织内的细胞的存活及生物学特性
。
因此，通常对组织进行一定的酶解，获取部分细胞，将剩余组织丢弃
。
组织贴壁法是从组织内分离可贴壁生长的细胞的一重要方法，其前提是组织密度高于培养基，组织能够靠重力贴附在培养皿的表面；
MSC
的特点是贴壁能力强，可贴壁生长，因此，该方法被广泛用于从脐带组织
(
其比重大于培养基
)
中分离
MSC。
但胎盘组织贴壁法分离
MSC
成功率很低，主要是由于胎盘组织整体密度较低
(
小于水
)
，在培养基中漂浮
。
胎盘组织由不规则的树状致密组织和其间的空隙
(
生理状态时填充血液
)
构成，致密组织难以用机械切割的方法分离
。
胎盘组织直接剪切形成的小块组织在生理盐水冲洗后有呈絮状的部分，接种到含培养基的培养瓶
(
或细胞工厂
)
后容易漂浮，组织内的
MSC
不能进行贴壁生长，难以实现
MSC
分离
。
[0004]组织冻存是保留细胞原始状态和基因表达完整性的重要方法
。
由于目前组织冻存程序复杂，商品化组织冻存液昂贵，有效组织冻存体积小
(
在
1mm3内
)
，多数商业化组织冻存实际上是保存组织酶解后获得的细胞，或将组织内的细胞进一步培养后获得的细胞
。
人胎盘组织
500g
左右，进行全组织冻存过于昂贵，如何选择性的最大限度的保存干细胞来源组织是一个挑战
。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一
。
为此，本专利技术提出一种从胎盘分离间充质干细胞的方法
。
[0006]本专利技术还提出上述从胎盘分离间充质干细胞的方法分离得到的间充质干细胞
。
[0007]本专利技术还提出上述从胎盘分离间充质干细胞的方法的应用
。
[0008]本专利技术还提出一种间充质干细胞的保存方法
。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提出了一种从胎盘分离间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在胎盘组织中加入含胶原蛋白
I
酶的生理溶液进行消化1‑
3h
后；固液分离，收集未完全消化的组织块；将所述未完全消化的组织块接种于培养基中进行贴壁培养，得到间充质干细胞
。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法还包括对胎盘组织进行前处理的步骤，所述步骤包括：将胎盘组织进行清洗后，分割成2‑
3cm
见方的胎盘组织小块；将胎盘组织小块进行清洗后，分割成2‑
3mm
见方的小组织块的步骤
。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述清洗采用含
10
‑
30
μ
g/mL
硫酸庆大霉素的生理盐水进行
。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述生理盐水的温度为2～
10℃。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述清洗的次数为2～5次
。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述分割的方式为采用剪刀进行处理
。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，还包括在小组织块中加入
DMEM
溶液后，进行固液分离，收集固相的步骤
。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，小组织块与
DMEM
溶液的添加质量体积比为
(1
～
2):(1
～
4)(g/mL)。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述
DMEM
溶液中含有终浓度为
10
‑
30
μ
g/mL
的硫酸庆大霉素
。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述生理溶液包括
DMEM。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述胶原蛋白
I
酶在所述生理溶液中的质量百分数为
0.1
～5％
。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述胶原蛋白
I
酶在生理溶液中的质量百分数为
0.1
～1％
。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述胶原蛋白
I
酶在生理溶液中的质量百分数为
0.5
％
。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述生理溶液还含有
0.000001
‑
0.00001
％氯化钙
。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述未消化完全的组织块的大小为
(200
～
800)
×
(200
～
800)
μ
m。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述消化的温度为
32
～
40℃。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述固液离心的步骤如下：将胎盘组织中加入含胶原蛋白
I
酶的生理溶液进行消本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种从胎盘分离间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在胎盘组织中加入含胶原蛋白
I
酶的生理溶液进行消化1～
3h
后；固液分离，收集未完全消化的组织块；将所述未完全消化的组织块接种于培养基中进行贴壁培养，得到间充质干细胞
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白
I
酶在所述生理溶液中的质量百分数为
0.1
～5％；优选地，质量百分数为
0.1
～1％
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生理溶液还含有
0.000001
～
0.00001
％氯化钙
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未消化完全的组织块的大小为
(200
～
800)
×
(200
～
800)
μ
m。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括
MSC
完全培养基；和
/
或，所述培养基还含有终浓度为5～
12
％胎牛血清
。6.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，未完全消化的组织块与培养基的添加质量体积比为
(0.05
～
2)
：
(10
～
14)g/mL。7.
一种间充质干细胞，通过权利要求1‑6任一项所述的方法制备得到；优选地，所述间充质干细胞中标志物
CD90、CD105
和
CD73
中的至少一种的阳性率大于
98
％
。
优选地，所述间充质干细胞中标志物
CD34、CD11b、CD19、CD45
和
HLA
‑
DR
中的至少一种的阳性率小于1％
。8.
一种间充质干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国梁，吴耀炯，卢瑞卿，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：