一种人载脂蛋白AV单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人载脂蛋白ＡＶ单克隆抗体及其应用，本发明专利技术的人载脂蛋白ＡＶ的单克隆抗体通过将人载脂蛋白ＡＶ免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后培养融合细胞而获得，该单克隆抗体可用于检测人血清中的人载脂蛋白ＡＶ。使用本发明专利技术提供的Ａｐｏ　ＡＶ的单克隆抗体可用于检测血清中的Ａｐｏ　ＡＶ，使用Ａｐｏ　ＡＶ单抗检测ＡｐｏＡＶ时，其线性检测范围大，血清中的ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＢ和Ｌｐ（ａ）对检测结果无影响，且检测结果稳定性好；因此，可使用本发明专利技术提供的Ａｐｏ　ＡＶ单克隆抗体制备相应的检测产品，以测定人血清中ＡｐｏＡＶ浓度，尽早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防与早期治疗。

Human apolipoprotein AV monoclonal antibody and application thereof

The invention provides a human apolipoprotein AV monoclonal antibody and application of the monoclonal antibody of human apolipoprotein AV by human apolipoprotein AV immunized mice splenocytes from the immunized mice were fused with myeloma cells, then cultured fusion cells obtained, the monoclonal antibody can be used for detection of people in the serum of human apolipoprotein AV. Using the monoclonal antibody provided by the invention can be used for detection of serum Apo AV in Apo AV, using Apo AV monoclonal antibody ApoAV, the linear detection range, serum ApoAI, ApoB and Lp (a) without influence on the test results and the test results, the stability is good; therefore, the detection of products can be provided by the invention of the Apo AV monoclonal antibody preparation of the corresponding, to determine the concentration of serum ApoAV, early screening high-risk population of coronary heart disease and timely prevention and early treatment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体的说，涉及一种单克隆抗体，更具体地说，涉及一种 人载脂蛋白AV单克隆抗体及其应用。
技术介绍
载脂蛋白AV是2001年Pennacchio等发现的一种新的载脂蛋白，它位于ApoAlV下 游-27kb的位置，与小鼠ApoAV和人类ApoAIV的碱基序列高度同源，其表达的蛋白质与 相邻基因产物ApoAlV也有高度的同源性，故命名为ApoAV。根据研究显示，ApoAV与血脂水平有关，特别是与甘油三酯水平密切相关，而甘油 三酯是冠心病独立的危险因素，载脂蛋白AV是目前为止发现的唯一与甘油三酯代谢有关 的载脂蛋白。因此，制备ApoAV单克隆抗体，以用于测定人血清中ApoAV浓度，对于尽 早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防与早期治疗具有重要意义。而现在尚未见到有关于ApoAV单克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于提供一种人载脂蛋白AV的单克隆抗体，以用于测定人血清中 ApoAV浓度。本专利技术的第二个目的，在于提供所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体的制备方法。 本专利技术的第三个目的，在于提供所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体的应用。 本专利技术的第四个目的，在于提供用于一种人载脂蛋白AV的检测产品。 本专利技术的第五个目的,在于提供一种可产生人载脂蛋白AV的单克隆抗体的融合细胞。 本专利技术的人载脂蛋白AV的单克隆抗体，通过将人载脂蛋白AV免疫小鼠，取免疫小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后培养融合细胞而获得。相应的，本专利技术的人载脂蛋白AV的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤A、 用人载脂蛋白AV免疫小鼠；B、 取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；C、 培养融合细胞以获得人载脂蛋白AV的单克隆抗体。本专利技术提供的人载脂蛋白AV单克隆抗体可用于检测人载脂蛋白AV。 本专利技术的人载脂蛋白AV的检测产品利用所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体制备。 根据本专利技术，所述检测产品可以是快速检测产品，优选的，所述快速检测产品为胶体 金试纸条或ELISA试剂盒。使用本专利技术提供的Apo AV的单克隆抗体可用于检测血清中的Apo AV，使用Apo AV 单抗检测ApoAV时，其线性检测范围大，血清中的ApoAI、 ApoB和Lp (a)对检测结果 无影响，且检测结果稳定性好；因此，可使用本专利技术提供的ApoAV单克隆抗体制备相应 的检测产品，以测定人血清中ApoAV浓度，尽早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防 与早期治疗。附图说明图1是PCR产物凝胶电泳结果，其中，泳道1为蛋白Marker (DL2000)，泳道2为 PCR产物。图2是western blot检测Apo AV的电泳结果，其中，泳道M为蛋白标准，泳道1为 重组Apo AV蛋白，泳道2为原倍人血清标本。 图3是重组Apo AV蛋白标准曲线。 图4是人血清滴度曲线。本专利技术所获得的可产生人载脂蛋白AV的单克隆抗体的融合细胞AV2G1和AVIFI， 己于2008年4月2日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号分别为CCTCC NO-C200805和CCTCC NO: C200804。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。 在下述实施例中使用的样本稀释液配方为l%BSA+0.1%Triton X-100 0.1M Tris pH8.0。在下述实施例中所有数据均采用SPSS 11.0统计软件分析，正态性检验用Shapiro-Wilk，相关性分析用Spearman计算相关系数。在下述实施例中，血清TG， TCHO， HDL-C及LDL-C的测定，均采用酶法在日立 7170全自动分析仪上完成。实施例l、抗原的制备以EX-W0804-B01 (购自GeneCopoeia)为模板，以F.primer和R.primer为引物，进 行PCR扩增，然后将获得的PCR产物与PQE30载体连接，获得重组菌株，并将其发酵培 养并纯化，获得所需抗原，具体过程如下所示1、 引物设计根据目标基因Genbank Acc#: NM_052968.3的序列，设计引物F.primer和R.primer， 其序列分别如下所示F.primer: CGCGGATCCGCACGGAAAGGCTTCTGGGA; R.primer: CCCAAGCTTTCAGGGGTCCCCCAGATGGCT 。其中，引物F.primer和R.primer中用下划线标识的分别是其BamH I和Hind III的酶切位点。2、 PCR扩增以EX-W0804德(购自GeneCopoeia)为模板，以F.primer和R.primer为引物，迸 行PCR扩增，具体条件如下所示扩增体系10XBuffer 5^1; dNTP (lOmM)各1^1; F.primer和R.primer各1^1;模板 DNA Pfu DNAPolymerase 0.5jal; Nuclease-Free Water,扩增条件94°C， 120s; 94°C， 30s， 55°C， 30s， 72°C， 120s， 30个循环;72°C， 360s; 4°C，过夜。然后，将扩增产物进行1 % Agarose凝胶电泳，结果如图1所示，在llOObp处有条带， 与预期的结果一致，使用胶回收纯化试剂盒(购自QIAGEN)回收目的条带并对其进行测 序，测序结果显示，插入片段的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示，其对应的氨基酸序列 如SEQIDNO: 2所示，根据上述结果，经PCR扩增获得了所需的目标片段。3、 重组质粒载体构建将纯化的PCR扩增片段经BamH I和Hind III酶切，与同样经BamH I和Hind III酶 切的PQE30载体(购自Novagen，含有Ampicillin (氨苄青霉素)抗性基因)，使用连接酶连接，并将获得的连接产物转化感受态细胞，培养，筛选，获得转化子。随机挑选3个转化子，抽提质粒进行测序，测序结果显示，其核苷酸序列如SEQ IDNO: 3所示，氨基酸序列如SEQIDNO: 4所示，根据该结果，获得的转化子中含有目标重组质粒。将转化子培养，并收获重组质粒。4、重组质粒转化、发酵及纯化将获得的重组质粒，转化五.o^'JM/09,获得重组菌株，然后，将获得的重组菌株发 酵培养，将获得的发酵液离心，并常规方法纯化，获得重组人血清脂质蛋白AV。实施例2、单克隆抗体的制备以人血清脂质蛋白AV为抗原，以Balb/c小鼠为免疫对象，制备单克隆抗体细胞，并 将获得的稳定的阳性单克隆抗体细胞进行培养，并进行纯化，以获得人血清脂质蛋白AV 的单克隆抗体，具体过程如下-2.1、动物免疫以Balb/c小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)为免疫对象，以实施例1制备获 得的人血清脂质蛋白AV为抗原，按照表1的免疫方案进行动物免疫，其中，第l-4次采 用皮下免疫注射方式进行免疫，第5次采用尾静脉注射方式进行加强免疫，并于免疫4天 后，将免疫好的Balb/c小鼠处死，并收获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人载脂蛋白ＡＶ的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体通过将人载脂蛋白ＡＶ免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后培养融合细胞而获得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，吴力军，刘光耀，田方艳，赵水平，胡敏，彭道泉，
申请(专利权)人：湖南远泰生物技术有限公司，中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]