具有人源化CD19SCFV的CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及人源化CD19单链可变片段(scFv)，其包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及CD19嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i)本发明专利技术的单链可变片段(scFv)、(ii)跨膜结构域、(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。本发明专利技术的人源化抗CD19scFv显示出对CD19的选择性和高亲和力结合。基于本发明专利技术的人源化scFv的CD19

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有人源化CD19 SCFV的CAR
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T细胞
[0001]序列表、表格或计算机程序的引用
[0002]序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS
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Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2020年2月25日，并且大小为18.6千字节。通过EFS
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Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。


[0003]本专利技术涉及衍生自小鼠FMC63抗体的人源化CD19 ScFv(克隆6，PMC288)。本专利技术还涉及使用本专利技术的人源化CD19 ScFv的CD19
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CAR
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T细胞。 CD19
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CAR
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T细胞可用于治疗白血病和淋巴瘤患者的细胞疗法中。

技术介绍

[0004]免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。可以将靶向肿瘤相关抗原 (TAA)的CAR
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T细胞输注到患者内(称为过继性细胞转移或ACT)，其代表有效的免疫治疗方法[1，2]。与化学疗法或抗体相比，CAR
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T技术的优点在于，重编程改造的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”) [1，3，4]。
[0005]CAR通常由以下组成：在N末端部分的单克隆抗体衍生的单链可变片段 (scFv)、铰链、跨膜结构域、以及与激活CD3
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ζ结构域串联的若干个胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4
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1BB)、CD27或其它共刺激结构域。 (图1)[1，2]。CAR的演变从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(具有若干个共刺激结构域)。生成具有两个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)使得CAR
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T细胞杀伤活性增加，并改善CAR
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T细胞持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。
[0006]图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或4
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BB)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[6]。
[0007]自然杀伤细胞或NK细胞是对先天性免疫系统至关重要的一类细胞毒性淋巴细胞。NK细胞发挥的作用类似于脊椎动物适应性免疫应答中的细胞毒性T 细胞的作用。NK细胞针对受病毒感染的细胞提供快速应答，在感染后约3天起作用，并且对肿瘤形成作出反应。
[0008]CD19
[0009]CD19是B细胞型淋巴细胞抗原，其在所有B细胞恶性肿瘤上表达，所述 B细胞恶性肿瘤包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)，和非霍奇金淋巴瘤。这种在白血病和淋巴瘤中的普遍表达使该抗原成为用CAR
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T细胞靶向的有吸引力的靶[3]。
[0010]CD19结构和信号传导
[0011]人CD19蛋白是95kDa跨膜糖蛋白，其如下所示由556个氨基酸组成： 20
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291
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细胞
外结构域；292
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313
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跨膜结构域；314
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556
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细胞质结构域(胞外结构域是加下划线的)。它属于免疫球蛋白超家族蛋白，且介导B细胞受体、BCR 依赖性和非依赖性信号传导。CD19与BCR和其它细胞表面蛋白结合，以通过结合其它激酶和结合配偶体来调节细胞内信号传导。CD19信号传导涉及Src 家族激酶、PI3激酶、Abl、AKT
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依赖性信号传导。CD19是B细胞介导存活信号传导和免疫应答的生物标志物。
[0012]附图说明
[0013]图1、CAR的结构
[0014]图2、人源化CD19
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CAR构建体的结构。使用第二代CD19
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CAR。
[0015]图3、人源化CD19
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CAR
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T细胞杀死Hela
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CD19细胞。如[4]所述， XCelligence实时细胞毒性分析用于检测人源化CD19
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CAR
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T和小鼠CD19
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41BB
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CD3 CAR
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T细胞的细胞毒性。标准化细胞指数显示于Y轴上，时间以小时计显示于X轴上。在右侧从上到下，单独的靶细胞；然后是加入靶细胞中的效应细胞：T细胞、模拟CAR
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T细胞、小鼠(M)CD19
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CAR
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T细胞、人源化(H)CD19 CAR
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T细胞。
[0016]图4、人源化CD19
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CAR
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T细胞对于Hela
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CD19阳性细胞分泌IFN
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γ。*： p<0.05，与Hela
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CD19细胞中的T细胞、模拟CAR
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T细胞相比，人源化CAR
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T 细胞和小鼠CD19
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CAR
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T细胞的IFN
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γ分泌。
[0017]图5、通过成像显示人源化CD19
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CAR
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T细胞和小鼠CD19
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CAR
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T细胞显著降低了小鼠异种移植瘤的生长。
[0018]图6、人源化CD19
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CAR
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T细胞显著降低了NSG小鼠模型体内的Raji
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荧光素酶异种移植瘤的总通量(成像信号)。人源化CAR
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T细胞和小鼠 CD19
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CAR
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T细胞在约基线时显示出总通量。*p<0.0001，CD19
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CAR
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T细胞相对于模拟、PBS处理的小鼠。
[0019]图7、人源化CD19
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CAR
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T细胞显著延长Raji异种移植瘤小鼠模型的存活期。卡普兰
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迈耶存活曲线(Kaplan
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Meier curve)显示了，与模拟CAR
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T细胞相比，人源化(h)CD19
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CAR
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T细胞和小鼠(m)CD19
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CAR
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T细胞显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人源化抗人CD19单链可变片段(scFv)，其包括SEQ ID NO:8的氨基酸。2.一种嵌合抗原受体(CAR)，其从N末端到C末端包括：(i)权利要求1所述的scFv，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。3.根据权利要求2所述的CAR，其中，所述共刺激结构域是CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，维塔，
申请(专利权)人：湖南远泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：