一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用技术

本发明专利技术提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，为避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料，本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单；生产工艺易于放大，对人力耗费较低；经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1

【技术实现步骤摘要】
一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用


[0001]本专利技术涉及慢病毒
，特别涉及一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。

技术介绍

[0002]慢病毒的生产工艺流程中粗毒液的收获，通常以HEK293T为包装细胞，使用含血清的混合培养基，在培养瓶或细胞工厂中贴壁培养，通过质粒瞬时转染的方式进行病毒包装。该方法技术相对成熟，操作简单易行，为很多实验室采用。然而，使用动物来源的血清，增加了外源病毒因子污染的风险；血清成分复杂，组分不明确，不符合药品生产注册的监管精神；血清引入的牛血清白蛋白，增加了纯化工艺和质量控制的难度；使用贴壁细胞包装慢病毒，工艺难以放大，产量难以提升，成本难以下降，且对劳动力消耗巨大；消化贴壁细胞使用动物来源的胰蛋白酶，可能引入外源病毒因子，增加质控难度等等问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，其目的是为了解决现有技术中上述问题。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术的实施例提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。
[0005]本专利技术的第一方面涉及了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其包含如下步骤：
[0006]步骤一：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15
‑
30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，细胞密度1r/>‑
10*10^4cells/mL，细胞总数为1
‑
10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；
[0007]步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；
[0008]步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5
‑
15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；
[0009]步骤四：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养48
‑
96h；
[0010]步骤五：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，共20
‑
40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
72h；
[0011]步骤六：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，共100
‑
300ml，使细胞
成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0012]步骤七：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1
‑
3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5
‑
10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM稀释至密度至1
‑
10*10^5cells/ml，工作体积20
‑
40mL，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0013]步骤八：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM稀释至密度至1
‑
10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0014]步骤九：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24
‑
48h；
[0015]步骤十：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM
‑
293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1
‑
10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0016]步骤十一：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24
‑
72h；
[0017]步骤十二：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM
‑
293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，将细胞稀释至1
‑
10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0018]步骤十三：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM
‑
293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，将细胞稀释至1
‑
10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0019]步骤十四：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，用OPM
‑
293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，将细胞稀释至1
‑
10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
48h；
[0020]步骤十五：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；用OPM
‑
293CD05培养基加入谷氨酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15
‑
30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，细胞密度1
‑
10*10^4cells/mL，细胞总数为1
‑
10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；S2：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；S3：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5
‑
15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，于37℃，5％CO2培养箱静置20
‑
30h；S4：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养48
‑
96h；S5：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，共20
‑
40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100
‑
150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
‑
72h；S6：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM，共100
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300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100
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150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
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48h；S7：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1
‑
3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5
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10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
‑
6mM稀释至密度至1
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10*10^5cells/ml，工作体积20
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40mL，于37℃、100
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150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
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48h；S8：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2
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6mM稀释至密度至1
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10*10^5cells/ml，于37℃、100
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150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24
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48h；S9：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24
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48h；S10：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM
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293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1
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10*10^5cells/ml，于37℃、100
‑
150rpm...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽建，周文婷，熊梓辰，吴珊珊，姜菊玲，
申请(专利权)人：湖南远泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：