一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法技术

本发明专利技术涉及线粒体提取技术领域，且公开了一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，包括以下步骤：取鱼剪鳃、放血、取肝，洗涤后将肝脏剪碎后用含BSA的缓冲液以清洗油脂；根据肝脏含量使用胰蛋白酶消化；消化后的组织缓慢匀浆，匀浆液添加蛋白酶抑制剂后进行超声破碎；破碎后的匀浆液低速离心以去除未破碎的细胞。该高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，操作简单易行，提取效率高，利用组织提取的MAM杂质少，另外采用胰蛋白酶消化组织间杂质，减少污染，提高细胞提取效率，并且通过适宜超声频率破碎细胞，增加MAM提取效率，如此，实现了提取黄颡鱼线粒体内质网偶联结构的目的。的目的。的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法


[0001]本专利技术涉及动物生物
，具体为一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法。

技术介绍

[0002]线粒体和内质网作为物质合成代谢的重要部位，为机体提供生命所需的能量并维持代谢平衡；线粒体内质网偶联是线粒体外膜与内质网膜之间形成的动态结构，其中包含多种蛋白，调控不同的信号通路，参与各式各样的生理作用；作为当前的生物学研究热点，MAM是调节线粒体和内质网功能交互的枢纽，维持着两者之间的信号传递与物质代谢的平衡。
[0003]目前国内外提取线粒体内质网偶联结构的方法主要是密度梯度超速离心法，并且相关的提取方法主要集中于细胞与部分哺乳动物，关于鱼类相关线粒体内质网偶联结构的提取方法未见到公开发表的专利和论文，另外鱼类所生活的环境与哺乳动物天差地别，细胞所处于的渗透压与其大小都具备显著差异，现存的提取方法在鱼类上不适用故而提出了一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，具备提取黄颡鱼线粒体内质网偶联结构等优点，解决了现存的提取方法在鱼类上不适用的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述适用性广目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，包括以下步骤：
[0008]1)处理黄颡鱼：取新鲜的黄颡鱼，剪鳃、放血、取肝，肝脏先在PBS中清洗2～3次，然后再用添加BSA的IU
‑
1洗涤2～3次，将洗涤后的肝脏加入预冷的IU
‑
3，清洗3～4次以去除血液，使用手术剪碎后捞出放置到烧杯中，可得到鱼肝的提取样本；
[0009]2)消化鱼肝样本：根据肝脏样本的含量，往烧杯中中添加胰蛋白酶进行鱼肝的消化反应；
[0010]3)制备均浆：在消化后的组织内加入STE缓冲液，使用匀浆机匀化1min，使组织均匀化，得到均匀浆液，然后在匀浆液内添加蛋白酶抑制剂，进行超声破碎，破碎匀浆液内的细胞；
[0011]4)差速获取粗线粒：把超声破碎后的匀浆液装入离心管中，把离心管放置到离心机中低速离心，去除未破碎的细胞，收集上清液，将收集到的上清液重新装入到离心管中，进行高速离心，高速离心完毕后，收集离心管中的沉淀物，获得粗线粒体；
[0012]5)粗线粒体重悬：把获取的粗线粒体按照组织含量用IU
‑
2重悬，比例为1：6，采用
差速离心减少粗线粒体污染；
[0013]6)离心沉淀：取薄壁离心管，按次序分层缓慢加入Percoll Medium、线粒体悬液和MRB，离心管底层条带是纯线粒体，其上层白色条带为MAM。
[0014]优选地，步骤1所述BSA浓度为3％，所述烧杯的容积为15ml。
[0015]优选地，步骤2所述添加胰蛋白酶进行鱼肝消化反应的消化时间为每次消5～10min，消化次数为2～3次。
[0016]优选地，步骤3所述超声破碎的频率为20～25％，破碎时间为3～5min。
[0017]优选地，步骤3所述STE缓冲液由Tris、sucrose和EDTA
‑
2K混合而成，且Tris、sucrose、EDTA
‑
2K的混合比例为1:1.5:1。
[0018]优选地，步骤4所述低速离心时离心力为850g，离心时间为10min，高速离心时离心力为12000g，离心时间为12min。
[0019]优选地，步骤5所述IU
‑
2包含甘露醇250mmol/L，蔗糖70mmol/L，Tris
‑
Hcl 30mmol/L和BSA1％。
[0020]优选地，步骤1所述IU
‑
1包含甘露醇250mmol/L、蔗糖70mmol/L、Tris
‑
Hcl 30mmol/L、BSA1％和EDTA 1mmol/L，IU
‑
3包含甘露醇250mmol/L、蔗糖70mmol/L和Tris
‑
Hcl 30mmol/L。
[0021]优选地，步骤6所述Percoll Medium甘露醇250mmol/L、HEPES 25mmol/L、EDTA 1mmol/L和30％Percoll(vol/vol)，MRB包含甘露醇250mmol/L、HEPES 5mmol/L和EDTA 0.5mmol/L。
[0022]优选地，所有试剂均调节PH为7.4并于4℃保存。
[0023](三)有益效果
[0024]与现有技术相比，本专利技术提供了一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，具备以下有益效果：
[0025]1、该高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，操作简单易行，提取效率高，利用组织提取的MAM杂质少，另外采用胰蛋白酶消化组织间杂质，减少污染，提高细胞提取效率，并且通过适宜超声频率破碎细胞，增加MAM提取效率，如此，实现了提取黄颡鱼线粒体内质网偶联结构的目的。
[0026]2、该高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，通过进行多次差速离心以充分去除现有方法中存在的细胞碎片问题，利用差速离心中多次的重悬步骤以减少胞浆污染，并且不断扩大重悬比例以稀释所包含的杂质，提高纯度。
附图说明
[0027]图1为透射电镜检测所提取黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联结构、线粒体与粗线粒体对比图；
[0028]图2为免疫印迹法验证所提取的线粒体内质网偶联结构纯化效果图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术
中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]实施例一：一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，包括以下步骤：
[0031]1)处理黄颡鱼：取新鲜的黄颡鱼，剪鳃、放血、取肝，肝脏先在PBS中清洗2～3次，然后再用添加BSA的IU
‑
1洗涤2～3次，将洗涤后的肝脏加入预冷的IU
‑
3，清洗3～4次以去除血液，使用手术剪碎后捞出放置到烧杯中，可得到鱼肝的提取样本；
[0032]2)消化鱼肝样本：根据肝脏样本的含量，往烧杯中中添加胰蛋白酶进行鱼肝的消化反应；
[0033]3)制备均浆：在消化后的组织内加入STE缓冲液，使用匀浆机匀化1min，使组织均匀化，得到均匀浆液，然后在匀浆液内添加蛋白酶抑制剂，进行超声破碎，破碎匀浆液内的细胞；
[0034]4)差速获取粗线粒：把超声破碎后的匀浆液装入离心管中，把离心管放置到离心机中低速离心，去除未破碎的细胞，收集上清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)处理黄颡鱼：取新鲜的黄颡鱼，剪鳃、放血、取肝，肝脏先在PBS中清洗2～3次，然后再用添加BSA的IU
‑
1洗涤2～3次，将洗涤后的肝脏加入预冷的IU
‑
3，清洗3～4次以去除血液，使用手术剪碎后捞出放置到烧杯中，可得到鱼肝的提取样本；2)消化鱼肝样本：根据肝脏样本的含量，往烧杯中中添加胰蛋白酶进行鱼肝的消化反应；3)制备均浆：在消化后的组织内加入STE缓冲液，使用匀浆机匀化1min，使组织均匀化，得到均匀浆液，然后在匀浆液内添加蛋白酶抑制剂，进行超声破碎，破碎匀浆液内的细胞；4)差速获取粗线粒：把超声破碎后的匀浆液装入离心管中，把离心管放置到离心机中低速离心，去除未破碎的细胞，收集上清液，将收集到的上清液重新装入到离心管中，进行高速离心，高速离心完毕后，收集离心管中的沉淀物，获得粗线粒体；5)粗线粒体重悬：把获取的粗线粒体按照组织含量用IU
‑
2重悬，比例为1：6，采用差速离心减少粗线粒体污染；6)离心沉淀：取薄壁离心管，按次序分层缓慢加入Percoll Medium、线粒体悬液和MRB，离心管底层条带是纯线粒体，其上层白色条带为MAM。2.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，其特征在于：步骤1所述BSA浓度为3％，所述烧杯的容积为15ml。3.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，其特征在于：步骤2所述添加胰蛋白酶进行鱼肝消化反应的消化时间为每次消5～10min，消化次数为2～3次。4.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，其特征在于：步骤3所述超声破碎的频率为20～25％，破碎时间为3～5min。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉峰，白震宇，罗智，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：