主动脉细胞单细胞悬液的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，通过先对主动脉血管组织进行处理，然后进行二次消化反应，以获得单细胞产率高、数量多、细胞活性高及细胞功能强的单细胞悬液，解决了传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题。获得的细胞质量差的技术问题。获得的细胞质量差的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
主动脉细胞单细胞悬液的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物
，尤其涉及一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法。

技术介绍

[0002]主动脉疾病是较为凶险的心血管疾病，常见的有主动脉夹层、壁间血肿、动脉粥样硬化、动脉瘤、马凡综合征、先天性主动脉疾患、外伤性疾患、主动脉炎症等。主动脉病变机制复杂，参与细胞种类繁多。随着单细胞测序技术的发展，对相关参与细胞的分析结果对主动脉疾病的攻克有重要的影响。但是由于主动脉血管韧性高，使得单细胞悬液的制备较为困难，很难获得效率高、活性高、功能强的单细胞以供相关病理学的研究。
[0003]因此，一种获得高效高质量的单细胞悬液的制备方法的出现势在必行。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，以解决相关技术中传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题。
[0005]本专利技术提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，包括：
[0006]S1、取主动脉血管组织，清洗，然后以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养，备用；
[0007]S2、取步骤S1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并切碎至1～2mm3的组织碎块，备用；
[0008]S3、按体积比例为1:(5～8)的比值分别取步骤S2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应第一时长，至无成形组织碎块，过滤、离心、去除上清液，得第一细胞悬液；
[0009]S4、按体积比例为1：(1.8～3)的比值分别取步骤S3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应第二时长，过滤、离心、去除上清液，得第二细胞悬液；
[0010]S5、将步骤S4中获得的第二细胞悬液用含10％牛血清的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。
[0011]可选地，在步骤S3中，所述组织消化悬浮液包括体积之比为(10:10:10:0:70～35:35:29:1:0)的胶原酶I：胶原酶II：透明质酸酶：DNA酶：含10％牛血清的1640培养基。
[0012]可选地，在步骤S1中，所述第一温度为0～4℃。
[0013]可选地，在步骤S1中，所述以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养的具体步骤包括：
[0014]置于冰上、并于含10％牛血清的1640培养基中无菌培养。
[0015]可选地，在步骤S3和S4中，所述过滤、离心的具体步骤包括：
[0016]用100um的筛网过滤，并于转速为1500rpm下离心时间为25～45分钟。
[0017]可选地，在步骤S4中，所述胰酶为质量浓度为0.02％的胰酶。
[0018]可选地，在步骤S3中，所述第一时长为4～5小时；和/或，
[0019]在步骤S4中，所述第二时长为18～35分钟。
[0020]可选地，所述牛血清为新生牛血清。
[0021]相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0022]本专利技术技术中，通过设计主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，拟先对主动脉血管组织进行处理，然后再通过至少二次消化反应获得其单细胞悬液，如此，以克服主动脉血管韧性高、制备主动脉血管细胞的单细胞悬液难的技术壁垒，并且得到了单细胞产率高、数量多、细胞活性高及细胞功能强的单细胞悬液，有效解决了传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题。
附图说明
[0023]图1为采用机械破碎主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的电镜图；
[0024]图2为对机械破碎主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的细胞测试结果数据；
[0025]图3至图8为本专利技术不同体积配比的组织消化悬浮液处理主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的电镜图。
[0026]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本专利技术中的技术方案进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0028]本专利技术提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，包括：
[0029]S1、取主动脉血管组织，清洗，然后以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养，备用；
[0030]S2、取步骤S1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并切碎至1～2mm3的组织碎块，备用；
[0031]S3、按体积比例为1:(5～8)的比值分别取步骤S2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应第一时长，至无成形组织碎块，过滤、离心、去除上清液，得第一细胞悬液；
[0032]S4、按体积比例为1：(1.8～3)的比值分别取步骤S3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应第二时长，过滤、离心、去除上清液，得第二细胞悬液；
[0033]S5、将步骤S4中获得的第二细胞悬液用含10％牛血清的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。
[0034]可选地，在步骤S3中，所述组织消化悬浮液包括体积之比为(10:10:10:0:70～35:35:29:1:0)的胶原酶I：胶原酶II：透明质酸酶：DNA酶：含10％牛血清的1640培养基。例如但不限于，在一实施例中，胶原酶I：胶原酶II：透明质酸酶：DNA酶：含10％牛血清的1640培养
基的体积配比为25:25:30:1:9。
[0035]应当理解，上述配制的组织消化悬浮液需要通过0.22um的滤膜过滤，以除菌。
[0036]例如但不限于，步骤S3中按体积比例为1:6的比值分别取步骤S2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应4小时。在步骤S4中按体积比例为1:2的比值分别取步骤S3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应20min。
[0037]可选地，在步骤S1中，所述第一温度为0～4℃。例如但不限于，所述第一温度为4℃。
[0038]可选地，在步骤S1中，所述以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养的具体步骤包括：
[0039]置于冰上、并于含10％牛血清的1640培养基中无菌培养。
[0040]可选地，在步骤S3和S4中，所述过滤、离心的具体步骤包括：
[0041]用100um的筛网过滤，并于转速为1500rpm下离心时间为25～45分钟。例如但不限于，所述离心时间为30分钟。
[0042]可选地，在步骤S4中，所述胰酶为质量浓度为0.02％的胰酶。
[0043]可选地，在步骤S3中，所述第一时长为4～5小时。例如但不限于，所述第一时长为4.5小时。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括：S1、取主动脉血管组织，清洗，然后以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养，备用；S2、取步骤S1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并切碎至1～2mm3的组织碎块，备用；S3、按体积比例为1:(5～8)的比值分别取步骤S2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应第一时长，至无成形组织碎块，过滤、离心、去除上清液，得第一细胞悬液；S4、按体积比例为1：(1.8～3)的比值分别取步骤S3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应第二时长，过滤、离心、去除上清液，得第二细胞悬液；S5、将步骤S4中获得的第二细胞悬液用含10％牛血清的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。2.如权利要求1所述的主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述组织消化悬浮液包括体积之比为(10:10:10:0:70～35:35:29:1:0)的胶原酶I：胶原酶II：透明质酸酶：DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺文辉，李军，程伟，余三九，何萍，许志臻，燕朝均，钟丹，戴双双，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：