【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鱼类生物，涉及蛋白质的翻译后修饰，具体涉及一种黄颡鱼sumo化修饰体系及其构建方法和应用。
技术介绍
1、锌在鱼类体内扮演着关键的角色，分布于生物体各个组织中，在鱼类的生长、骨骼发育、免疫系统、内分泌平衡以及核酸与蛋白质的合成等多个生理活动中都起着至关重要的作用，是其不可或缺的微量元素之一。在鱼类养殖中，锌的合理供应具有重要意义。锌缺乏会引发多种症状，如食欲不振、蛋白质和碳水化合物的消化率降低、生长受抑制、dna损伤以及氧化应激、机体抵抗能力下降、死亡率上升等。然而，过量的锌积累也是有害的，可导致神经和免疫功能受损，最终导致溶血性贫血。饲料中锌含量的不足或过剩都会直接影响鱼类的生长和饲料利用效率。此外，需要注意的是锌是一种重金属元素，其过量排放不仅可能对水体生态系统产生负面影响，还对环境污染构成潜在威胁。因此，深入研究锌的供应和代谢并为水产养殖和饲料生产提供科学有据的精准营养数据，有利于鱼类的健康以及养殖业和饲料行业的生态良好可持续性发展。
2、不论是海水鱼还是淡水鱼，它们都能够从环境中通过鳃和胃肠道系统吸收锌。饲料被认为是鱼类获取锌的主要来源，鱼类对饲料中的锌吸收在肠道前部最高。锌通过肠道上皮细胞的吸收转运，进入到机体中发挥各种生理功能，因此，生物体的锌稳态调控机制显得尤为关键。锌的稳态调节是由锌转运蛋白完成的，这些蛋白负责调控锌在细胞和胞内膜之间的运输。锌在鱼类体内的吸收、转运和稳态调控机制非常复杂，涉及多个关键蛋白质，其中包括znts和zips家族蛋白、金属硫蛋白以及金属反应转录因子1。锌转运蛋白
3、蛋白质翻译后修饰(ptms)指的是蛋白质在其翻译完成后发生的化学修饰。ptms是一种复杂的过程，几乎涉及到细胞内的所有生命活动，具有关键的调控功能。这些修饰使蛋白质的结构更加复杂，功能更加专一和完善，因此ptms拥有巨大的生命科学研究和探索潜力。sumo(smallubiquitin-relatedmodifier)化修饰作为一种重要的可逆的蛋白质翻译后修饰方式，在调控蛋白质的活性、稳定性和定位方面发挥着极其关键的作用。sumo化修饰在生物体内具有调控生物学过程中的功能，它的功能主要依赖于目的蛋白，而机体内许多与转录调控和信号传导相关的蛋白质都是sumo化修饰的靶蛋白。sumo可与底物蛋白结合，参与调控靶基因的转录活性、维持基因组完整性、调控蛋白质的亚细胞定位以及调节蛋白质稳定性等关键的生物学过程。
4、sumo化修饰过程包含四个连续的酶促反应过程：首先，sumo特异性蛋白酶(sentrin/sumo-specific proteases,senps)促使sumo成熟化，然后e1酶激活sumo，接着活化的sumo与e2酶结合，最后，e3酶促进sumo与底物蛋白结合。首先，sumo的c末端氨基酸会被senps降解，这一过程使得sumo的双甘氨酸残基得以暴露，形成成熟的sumo分子。随后，在atp的参与下，sumo的甘氨酸残基会与e1激活酶的半胱氨酸残基发生结合形成硫酯键，从而生成活化的sumo。e1酶是由sumo活化酶亚基1(sae1)和sumo活化酶亚基2(uba2)构成的atp依赖性异二聚体。sae1/uba2具有特异性，可以识别目前已知唯一的e2结合酶(ubc9)，通过酯交换反应将sumo转移至ubc9的半胱氨酸残基上，形成高能硫酯键。最终，在e3连接酶的催化作用下，ubc9直接辨识底物蛋白中的保守序列ψ-kxd/e，其中ψ代表疏水基团，k代表与sumo结合的赖氨酸，x代表任意氨基酸，d/e代表底物蛋白中的天冬氨酸或谷氨酸等组成的酸性氨基酸，将sumo与底物蛋白的赖氨酸残基结合，形成牢固的异肽键，从而完成sumo与底物蛋白之间的特异性结合。
5、综上所述，锌转运蛋白的正常生理功能对鱼类机体的锌稳态具有至关重要的作用，且sumo化修饰也是机体中各种生物学过程必不可少的。尽管已有组学数据表明许多锌转运蛋白可能是sumo化修饰的靶蛋白，sumo化修饰可能间接调控机体锌稳态，但是哪些锌转运蛋白能够发生sumo化修饰以及sumo化修饰如何调控机体锌稳态目前尚无文献报道。因此，建立科学可靠的黄颡鱼锌转运蛋白sumo化修饰分析鉴定方法，对于研究sumo化修饰调控锌转运蛋白对锌在机体中的代谢和利用具有非常重要的意义。并有助于深入研究sumo化修饰在鱼类锌稳态调控中的作用机理，加强我们对锌的营养及生理功能的认识，为鱼类sumo化修饰的研究和锌稳态的调控提供理论支持和研究手段。此外，本专利技术还利用该体系方法，结合分子生物学技术，建立了一套筛选、验证黄颡鱼sumo化靶标蛋白和sumo化位点的技术体系和流程，本方法将大大提高黄颡鱼sumo化靶标蛋白和靶位点筛选及鉴定的效率及成功率，并可以用于研究影响黄颡鱼sumo化修饰的激活剂和抑制剂的作用机理和应用。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种黄颡鱼sumo化修饰体系及其构建方法和应用，解决的技术问题是克服现有鉴定黄颡鱼体内锌转运蛋白能否发生sumo化修饰方法的复杂繁琐且无法鉴定发生sumo化修饰位点的局限性，以及弥补体外鉴定黄颡鱼sumo化修饰底物和sumo化修饰位点方法的空白。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种黄颡鱼sumo化修饰体系，所述修饰体系以真核表达质粒载体pcdna3.1(+)为模板，在hindiii和xhoi两个酶切位点之间插入有融合蛋白基因；所述融合蛋白基因为携带标签蛋白基因的sumo化修饰相关蛋白基因。
3、优选地，所述sumo化修饰相关蛋白基因为sumo1、sumo2、sumo3、sae1、uba2、ubc9、pias1、zip8中的任意一种；所述标签蛋白基因为表达以下任意一种标签蛋白的碱基序列：his标签、flag标签、myc标签、ha标签、egfp标签。
4、上述黄颡鱼sumo化修饰体系的构建方法，包括以下步骤：
5、1)以黄颡鱼全长cdna为模板进行pcr扩增，得到融合蛋白基因的pcr产物；
6、2)以所述融合蛋白基因的pcr产物为模板进行第二轮pcr扩增，得到两端含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因的pcr产物；
7、3)使用限制性内切酶对pcdna3.1(+)真核表达质粒载体的hindiii和xho i酶切位点进行双酶切，得到线性化的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体；
8、4)将第二轮pcr产物与线性化的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体进行同源重组，将得到的重组产物分别转化进新鲜的dh5α感受态大肠杆菌细胞，得到含融合蛋白基因的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体。
9、优选地，所述步骤1)中：
10、当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo1时，myc-sumo1的pcr扩增引物如下：
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1.一种黄颡鱼SUMO化修饰体系，其特征在于：所述修饰体系以真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)为模板，在Hind III和Xho I两个酶切位点之间插入有融合蛋白基因；所述融合蛋白基因为携带标签蛋白基因的SUMO化修饰相关蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的黄颡鱼SUMO化修饰体系，其特征在于：所述SUMO化修饰相关蛋白基因为sumo1、sumo2、sumo3、sae1、uba2、ubc9、pias1、zip8中的任意一种；所述标签蛋白基因为表达以下任意一种标签蛋白的碱基序列：His标签、Flag标签、Myc标签、HA标签、EGFP标签。
3.一种权利要求1所述黄颡鱼SUMO化修饰体系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中：
6.一种黄颡鱼SUMO化靶标蛋白SUMO化修饰位点突变融合蛋白表达质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.一种重组细胞，其特征在于：所述重组细胞为含有权利要求1或2所
8.一种提取细胞内SUMO化修饰相关融合表达蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.下列任意一项在调控黄颡鱼锌吸收转运中的应用，其特征在于：
10.下列任意一项在黄颡鱼养殖效益提高、免疫应答优化、疾病抗性增强中的应用，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种黄颡鱼sumo化修饰体系，其特征在于：所述修饰体系以真核表达质粒载体pcdna3.1(+)为模板，在hind iii和xho i两个酶切位点之间插入有融合蛋白基因；所述融合蛋白基因为携带标签蛋白基因的sumo化修饰相关蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的黄颡鱼sumo化修饰体系，其特征在于：所述sumo化修饰相关蛋白基因为sumo1、sumo2、sumo3、sae1、uba2、ubc9、pias1、zip8中的任意一种；所述标签蛋白基因为表达以下任意一种标签蛋白的碱基序列：his标签、flag标签、myc标签、ha标签、egfp标签。
3.一种权利要求1所述黄颡鱼sumo化修饰体系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：
5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗智，刘涛，谭肖英，宋长春，段芙萱，余岸艮，宋玉峰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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