一种纯化普兰林肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化普兰林肽的方法，属于ＨＰＬＣ技术领域，包括以下步骤：１）将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为Ａ相、色谱纯乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；２）将步骤１）纯化所得目的肽溶液浓缩后用固定相为反向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为Ａ相、色谱纯乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；３）将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。本发明专利技术使用反相高效液相色谱法与阴离子交换法纯化普兰林肽，纯度高且收率好，提供了一条适于规模化纯化亮丙瑞林的工艺方法，达到产业化要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于HPLC
，尤其是涉及一种规模化纯化普兰林肽(Pramlintide )的方 去。
技术介绍
普兰林肽(Pramlintide )中文制剂名称为醋酸普兰林肽，英文名为Pramlintide acetate，分子式CmH267N51053S2x(C2H402)x(H20)，分子量3949.39，CAS登录号196078-30-5。普兰林肽是一种治疗糖尿病的多肽药物，其效果较好且副作用小，具有很好的市场前景。在已发表的文献和专利中，未有大规模生产、并且具有较高收率的纯化工艺报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一条适于产业化纯化普兰林肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化普兰林肽，纯度高且收率好，达到产业化要求，解决现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案，包括以下步骤1) 将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；2) 将步骤1)纯化所得目的肽溶液浓縮后用固定相为反向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；3)将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。 优选的方案是所述的反向硅胶柱为十八垸基硅烷键合硅胶。 更为优选的方案是所述步骤1)三氟乙酸水溶液浓度为0.1% (V:V);检测波长为230 nm。更为优选的方案是所述步骤2)磷酸盐水溶液pH值为7.0 8.0。更为优选的方案是所述的阴离子交换转盐法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是AmberlitelRA-93。本专利技术与现有技术相比，有如下优点和有益效果本专利技术使用反相高效液相色谱法与阴离子交换法纯化普兰林肽，纯度高且 收率好，提供了一条适于规模化纯化亮丙瑞林的工艺方法，达到产业化要求。具体实施方式 实施例l1. 样品处理粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用 0i.45pm滤膜过滤，收集滤液备用。2. 第一次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅垸键合硅胶为固定相的 色谱柱,柱子直径和长度为5 cm x 25 cm。流动相A相0.1%三氟乙酸水 溶液；B相乙腈。流速70-80ml/min。检测波长230nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。进样量为1.5-2.0 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5-2.0g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超 过32 t下减压旋蒸浓縮至约50-60 mg/mL后备用。3. 第二次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的 色谱柱，柱子直径和长度为5cmx25cm。流动相A相20mmol/L磷酸二 氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0; B相乙腈。流速55-60 ml/min。检测波 长230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。进样量为1.5-2.0 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为30-40ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32 °C下减压旋蒸浓縮至约50-60 mg/mL后备用。4、转盐色谱柱填料为阴离子交换树脂AmberliteIRA-93，柱子直径和长度为5 cm x 25 cm 。流动相0.1-0.3%醋酸水溶液。流速55-60 ml/min。检测波长280 nm。进样量为1.5-2.0g 。转盐过程将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为30-40ml样品溶液。0.1-0.3。/。醋酸水溶液洗脱60min,收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并于水温不超过32'C下减压旋蒸浓缩至约80-100 mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的符合标准的普兰林肽，纯化收率41.2%。实施例21. 样品处理粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用0:O.45^im滤膜过滤，收集滤液备用。2. 第一次纯化纯化条件色谱柱以十八垸基硅垸键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为15cmx25cm。流动相A相0.1%三氟乙酸水溶液；B相:乙腈。流速500-550 ml/min。检测波长230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。进样量为15-20 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为15-20g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32 "下减压旋蒸浓縮至约50-60 mg/mL后备用。3. 第二次纯化纯化条件色谱柱以十八垸基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为15cmx25cm。流动相A相20mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0; B相乙腈。流速500-550 ml/min。检测波长230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。进样量为15-20 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为300-400ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32 'C下减压旋蒸浓縮至约50-60 mg/mL后备用。4、转盐纯化条件色谱柱填料为阴离子交换树脂Amberlite IRA-93，柱 子直径和长度为15cmx45cm。流动相0.1-0.3°/。醋酸水溶液。流速150-170 ml/min。检测波长280 nm。进样量为10-15g。转盐过程将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为300-400 ml样品溶 液。0.1-0.3%醋酸水溶液洗脱75 min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温 不超过32'C下减压旋蒸浓縮至约80-100 mg/mL。后转至合适大小西林瓶。冷冻 干燥后即可得到纯度大于98%的符合标准的普兰林肽，纯化收率达43.3%。实施例31. 样品处理粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用 04.45pim滤膜过滤，收集滤液备用。2. 第一次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅垸键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为30cmx25cm。流动相A相0.1%三氟乙酸水溶 液；B相:乙腈。流速2000-2200 ml/min。检测波长230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。进样量为65-75 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为 65-75g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过 32 。C下减压旋蒸浓縮至约50-60 mg/mL后备用。3、 第二次纯化纯化条件色谱柱以十八垸基硅垸键合硅胶为固定相的 色谱柱，柱子直径和长度为30cmx25cm。流动相A相20mmol/L磷酸 二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0; B相乙腈。流速2000-2200 ml/min。 检测波长230 nm。梯度B%: 25% 45°/。 (45min)。进样量为65-75 g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为 1.3-1.5L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于 水温不超过3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化普兰林肽的方法，包括以下步骤：　１）将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为Ａ相、色谱纯乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；　２）将步骤１）纯化所得目的肽溶液浓缩后用固定相为反 向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为Ａ相、色谱纯乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；　３）将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：康旭，覃亮政，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳市翰宇药业有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]