本发明专利技术涉及纯化替考拉宁的方法，特别地，涉及通过使用商购疏水性或适度极性吸附树脂吸附来自替考霉素游动放线菌培养物的发酵肉汤滤液中特定溶剂的成分与进一步从树脂上洗脱产物有效除去杂质的方法。根据本发明专利技术，该方法包括在所述纯化方法的不同步骤时使用水溶液形式的与水混溶的有机溶剂的混合物，诸如在上述的洗脱步骤和/或在截止值3-100kDa的膜上的超滤步骤。该方法还进一步包括用碳处理替考拉宁溶液，例如在洗脱之后和超滤之前。优选地，所述的与水混溶的有机溶剂选自C1-C4醇类、C3-C4酮类或C2-C4腈类。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 专利
本专利技术涉及化学
，更具体地，本专利技术涉及抗生素替考拉宁的新的和有效 的纯化方式。 专利技术背景 替考拉宁是来自由真菌微生物例如替考霉素游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus)产生的万古霉素-利托菌素家族的一组糖肽抗生素的常用术语。替考 拉宁在J.Antibiotics31 (1978)，p. 170-177中首先作为称作太古霉素八^^和^的三因子 混合物公开。因子A2、后来称作替考拉宁A 2被鉴定为主要成分，其通过Sephadex LH-20? 柱色谱法分离。替考拉宁A2随后被识别为5种分子的混合物（J. Antibiotics37 (1984)， p. 615-620)，其迅速地被解释为在酰基-脂族侧链性质方面不同的结构（J. Am. Chem. Soc. 106(1984) ,4895-4902)。替考拉宁的典型和示例性化合物代表如图1中所示（R可以 表不不同的C1(rC n-烧基残基）。这5种A2化合物构成了替考拉宁与另一种主要成分（A3) 和一些次要成分（例如R s-1至Rs-4)。 以有限比例变化形式的这些成分的混合物作为治疗革兰氏阳性菌感染的 Targocid?销售。除万古霉素和万古霉素类抗生素外，仍然存在针对高度耐受性微生物 的关键活性化合物。 已经进行了大量尝试从微生物的培养肉汤中分离替考拉宁并且纯化替考拉宁以 达到药用级。根据首先在US 4239751中的公开内容，将培养肉汤分成菌丝体饼和滤液。在 处理所述饼后，用丁醇在酸性pH下提取肉汤级分并且在部分除去溶剂后沉淀粗发酵产物。 采集沉淀，用Sephadex LH20柱和酸性离子交换树脂例如Amberlite IR-120和Dowex50纯 化，并且通过在4°C下沉淀分离产物。然而，该方法是实验室分离试验，对于工业化应用而言 存在复杂性、质量、成本和收率这几方面的缺陷。 为了改善这种自我抑制的替考拉宁生产中的发酵收率，尝试通过向培养肉汤中添 加与水混溶的有机溶剂例如丙酮、正丙醇和乙腈（韩国专利KR367890)或通过向其中添加 强酸性阳离子交换树脂例如Dow XFS-43278. 00和Diaion SK-1 02(韩国专利KR 118034) 连续取出产物。但这种方法仍然需要大量有机溶剂来提取替考拉宁，产生操作难题和环境 污染。 美国专利申请US4, 845, 194报道了用于纯化替考拉宁的方法，包括阳离子交换技 术，但预先不进行pH调整。使用具有约9-约12pH值的溶液从阳离子交换树脂中洗脱替考 拉宁。 通过使用专用的聚酰胺树脂使首先在EP 0241758中公开的替考拉宁有效地结合 疏水性树脂的发现，并且通过在碱性pH下从菌丝体中提取替考拉宁的方法作为主要公开 方法（EP 0479086)的简化，进一步取得了在分离替考拉宁中的进展。然而，替考拉宁的纯 度不会高于85%且脱色不充分。 引入商品疏水性树脂、优选作为柱而非混悬液处理施用代表了另一种进步。出版 物 J. Biochem. 275 (2000)，p. 6201-6206 描述了商品疏水性树脂 Dianion HP2MGL? 的应用与 使用NaOH溶液的进一步洗脱。然而，该方法需要连续中和洗脱溶液以防止对碱敏感的产物 表异构化。尽管伴随其它专用方法以得到纯替考拉宁，但是鉴于仅50-60% (w/w)的纯度， 所以这种实验室方法更适合于非药用成分的目的。 韩国专利KR 321304公开了中性吸附树脂和使用选自Amberlite XAD16、Diaion HP20、硅胶和活性炭的树脂的外源凝集素-固定的亲和色谱法。然而，在使从碱性溶液中提 取的过滤培养肉汤吸附在树脂例如Diaion HP20上的情况中，大量替考拉宁在吸附步骤中 损耗，且通过甲醇浓度梯度洗脱的替考拉宁纯度极低。此外，必须除去甲醇以便将溶液上外 源凝集素-固定的树脂。此外，因外源凝集素-固定的树脂的成本问题而并不期望应用于 大规模生产策略。 根据韩国专利申请KR 2003/017067，使培养肉汤的替考拉宁吸附在多孔吸附树脂 上，用稀盐酸洗涤多孔吸附树脂并且使用水和丙酮的混合溶液使替考拉宁从吸附树脂上解 吸。通过真空蒸馏浓缩包含替考拉宁的洗脱溶液，用活性炭处理，并且碱性沉淀法，且由此 纯化替考拉宁。此外，该方法因替考拉宁不可逆地吸附在树脂上而降低了收率并且因使用 大量溶剂不足以按比例放大。此外，难以仅使用应用多孔吸附树脂的单一方法将替考拉宁 纯化至95面积％或以上。 或者，一些另外的研究已经包括反相树脂以便从培养肉汤中分离和纯化替考拉 宁。例如，公布在 Chromatographia24 (1987) ρ· 295-301 中的方法提出 了使用 Lichrosorb? 树脂纯化替考拉宁，但使用大量乙腈且随后碱性树脂交换可能显著地提高生产成本。两种 另外的可替代选择伴随使用反相树脂的色谱法，并且附加纯化方式。例如，韩国专利申请KR 2003/092504描述了用丙酮水溶液提取发酵产物，随后在硅烷包被的硅胶上进行色谱处理， 在分离步骤中在活性炭上吸附，并进行超滤。US 7405267描述了从培养肉汤中纯化替考拉 宁的方法，其包括使用合成吸附剂的主要纯化步骤；使用阳离子交换树脂、催化树脂或螯合 型树脂的二次纯化；使用反相树脂的第三次纯化步骤；和最终的冻干步骤。因此，过多昂贵 的反相的单独的应用不能避免使用另外的吸附剂，由此不能成为额外成本的理由。 概括而言，所有上述方法仅提供了部分解决方案，它们未解决分离和纯化替考拉 宁的复杂性问题。专利EP 1735337B1(W0 2005/116059)提供了迄今为止最为综合性的分 离和纯化替考拉宁的解决方案。其追溯到用疏水性树脂的吸附方法，该方法描述了如下纯 化和分离替考拉宁的关键步骤： -将菌丝体与在滤液中溶解的替考拉宁中分离； -使来自pH6. 5-7. 5的中性10-40% Q-C；-醇类或C3-C4-酮类水溶液介质的粗纯 化的替考拉宁吸附在多孔吸附树脂上，然后用40-90% Ci-C；-醇类水溶液洗脱，其中谨慎地 控制盐浓度； -使用根据具有最大30%的甲醇水溶液粗略计算的稀醇水溶液使杂质吸附在活 性炭上； -通过吸附在多孔树脂上脱盐，然后用40-90% Ci-C；-醇类水溶液洗脱； -用具有3-100kDa孔径的膜在0_4kPa压力下、使用浓度低于纯化20%的替考拉 宁的稀水醇溶液超滤；-沉淀替考拉宁。 尽管该方法可以代表分离替考拉宁的最佳文献选择，但是其再现性令人意外地显 示存在明显的缺陷： -从多孔树脂中脱盐不完全（最大87. 6% ); -减小超滤中的孔径令人意外地减少了通过膜的替考拉宁，不过，孔是明显大于替 考拉宁分子半径，而使用较大的孔降低了选择性，由此需要几个循环的超滤，从而将溶剂介 质的量提商至庞大体积； -除去有色的杂质仍然是主要问题，因为颜色在用树脂吸附步骤未被完全除去，在 使用活性炭和超滤脱色期间也没有被完全除去。 随后的公开文献CN 101423547A代表了通过按照预先步骤将替考拉宁溶液调整 至2, 5-6的所述综合性方法的修订，所述预先的步骤例如： -将菌丝体与在滤液中溶解的替考拉宁分本文档来自技高网...
【技术保护点】
纯化的替考拉宁的制备方法，该方法包含下列步骤：a)使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上；b)使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质使替考拉宁从所述树脂上解吸；c)用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭；d)对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3‑100kDa截止值的膜的超滤法，其中该溶液包含20％(v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90％(v/v)的与水混溶的有机溶剂；e)在通过用具有1000Da截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩包含替考拉宁的溶液和/或使其脱盐；f)得到纯化的替考拉宁。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.11 EP 11188759.21. 纯化的替考拉宁的制备方法，该方法包含下列步骤： a) 使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上； b) 使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质使替考拉宁从所述树脂上解吸； c) 用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭； d) 对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3-100kDa截止值的膜的超滤法，其中该溶液 包含20% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90% (v/v)的与水混溶的有机溶剂； e) 在通过用具有l〇〇〇Da截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩包含 替考拉宁的溶液和/或使其脱盐； f) 得到纯化的替考拉宁。2. 根据权利要求1的方法，其中如权利要求1的顺序进行步骤a)-f)。3. 根据权利要求1或2的方法，还包含将有机溶剂添加到替考霉素游动放线菌培养物 中的预先步骤，并且通过过滤和/或离心除去菌丝体和其它不溶物。4. 根据权利要求1或3任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂是具有20 - 500人 孔径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯交联的非离子型大孔树脂。5. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂选自 Hypersol-Maeronet? ^ Dowex? o p t i p 〇 r e、 Amberlite? x A d l 6、 Amberlite? XAD1600、Amberlite? XAD1180、Diaion? HP2〇、Diaion? Sepabeads SP207 和Dienion? HP2MG。6. 根据权利要求1-5任一项的方法，其中使用包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂的水性介质进行从疏水性吸附...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·安德伦塞克，D·赛尼卡，
申请(专利权)人：力奇制药公司，
类型：发明
国别省市：斯洛文尼亚;SI
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。