丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂及不干胶封片和使用说明书；其中所述酶标板为化学发光酶标板且其各孔包被有浓度为５ｕｇ／ｍｌ的包被抗体Ｍａｂ１和Ｍａｂ２；所述试剂包括：抗ＨＣＶ－ｃＡｇ酶结合物、ＨＣＶ核心抗原标准品梯度溶液、阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、ＨＣＶ－ｃＡｇ样品稀释液、化学发光底物液Ａ、化学发光底物液Ｂ、２０×浓缩洗涤液。本发明专利技术的检测试剂盒阳性检出率与ＰＣＲ阳性检出率接近，同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，适于在临床推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒抗原检测试剂盒，尤其涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)化学发光酶联免疫检测试剂盒及该试剂盒的制备方法。
技术介绍
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染而引起的，主要经过血液传播。全世界有 1. 7亿人感染了 HCV，预计我国HCV感染者3800万，而且每年的新发病例数不断上升。 与乙肝相比，丙肝更容易转成慢性，约有70%的丙肝有可能发展成慢性肝炎，20%发展 成肝硬化，12%发展成肝癌，危害十分地严重。目前，慢性丙肝除了干扰素有确切的疗 效外，尚没有其它有效的治疗方法，而且疫苗的研制在短期内难有突破性的进展，因此， 早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要的意义。现在常用的HCV检测技术主要是抗体的检测和RNA的检测，但是各有缺陷。自1989 年，HCV抗体诊断试剂确诊出第一例HCV阳性感染者以来，抗体诊断试剂已经发展到了 第四代。尽管检测灵敏度在不断提高，但是窗口期(即从病毒感染起直到可以检测出该 病毒标志物之前的时期)仍然存在，这是输血安全的重大威胁之一。抗体检测也不能区 分感染活动期患者和病情康复者，不能用于患者的疗效监测；腦A检测分为定性和定量 两种，HCV RNA检测直接检测HCV病毒是否存在，其基本原理是逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)。虽然RNA检测可以早期诊断HCV感染，而且特异性好灵敏度高，但该方法 在设备和技术上要求较高，且人员需要专职培训，操作繁琐，假阳性高，因此难以在常 规工作和基层实验室中推广，限制了其应用。HCV病毒核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一，氨基酸序列十分保守，有研究 表明其在血清中的滴度与HCV RNA水平密切地相关，而核心抗原与RNA动力学变化密切 相关，因此可做为病程进展或抗病毒治疗的疗效监测的指标。HCV核心抗原的检测是一 新型的检测方法，研究始于上世纪九十年代中期，应用最广泛的是酶免疫方法。美国 0rtho公司已经推出了双抗体夹心法定性和定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心 抗原ELISA试剂盒，于2004年已经在欧洲上市。中国仅有湖南景达制药有限公司于2005 年推出的核心抗原的ELISA检测试剂盒。但是HCV核心抗原的酶联免疫法灵敏度不高， 因此其推广使用也受到局限。所以专利技术一种既操作简便又灵敏度高的试剂盒具有非常重 要的临床意义。
技术实现思路
针对现有丙型肝炎抗体诊断试剂检测"窗口期"过长，且丙型肝炎抗原酶联免疫 检测试剂盒灵敏度不高的不足，为避免现有检测方法的局限性，本专利技术的目的在于提供 一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒。本专利技术所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在 盒体内的酶标板和设在盒体内的抗HCV-cAg酶结合物、HCV核心抗原标准品梯度溶液、 阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、 化学发光底物液B、 20X浓縮洗涤液及不干胶封片和使用说明书；其特征在于，所述酶 标板为乳白色不透明聚苯乙烯96或48孔化学发光酶标板，且其各孔包被有浓度为5ug/ml的包被抗休Mabl和Mab2;所述抗HCV-cAg酶结合物是辣根过氧化酶标记的羊抗 兔的M油3和Mab4抗体所述标准品溶液为5个浓度梯度，分别是20ng/ml、 10ng/ml、 5ng/ml、 lng/ml、 20pg/ral;预处理液为体积比0.3% TritonXlOO、重量比1. 5%SDS和 G. 1M、pH8. 0的Tris-HCL的混合液；化学发光底物液A是3. Ommol/L鲁米诺与0. 3mmol/L 对碘苯酚的混合液，化学发光底物液B为7. 5mmol/L的双氧水。上述的包被抗体Mahl包含HCV核心区20 35氨基酸位置，Mab2包含HCV核心区 35 50氨基酸位置，Mab3包含HCV核心区100 115氨基酸位置，MaM包含HCV核心区 115 130氨基酸位置。本专利技术中，所述阳性血清对照为从HCV感染者静脉采血后分离的血清，其制备方法 是经EIA和分片段确认HCV四种(HCV-C、 NS3、 NS4、 NS5)抗原均阴性；经PCR法测定HCV 为阳性，抗I1IV、 HBsAg亦为阴性，60'C水浴1小时后除菌过滤，-20'C保存；所述阴性 血清对照为正常献血员的血淸，其制备方法是经HCV四种(HCV-C、 NS3、 NS4、 NS5)抗 原分别检测均为阴性、抗HIV、 HBsAg及TP亦为阴性的人血清，除菌过滤后-20'C保存。所述HCV-cAg样品稀释液的配方及制法是山羊血清 100ml1% (重量比)硫柳汞 20ml0. 1M铁氰化鉀 10ml吐温-20 0. 5ml10mg/ml庆大霉素 10ml力口0.01M PBS(PH7. 4)至1000ml，过滤除菌，4'C保存。所述20X浓縮洗涤液的配方及制法是NaH2P04 2H20 2. 96gNa2HP04 12H20 29gNaCl 234g吐温-20 20ml加双蒸水至1000ml,过滤除菌，4'C保存。本专利技术所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用方法，其检 测程序为(1)平衡样品及检测试剂盒内的试剂，于18 25°C平衡30±5分钟； (2)配液将浓縮洗涤液用蒸馏水稀释20倍，制成工作浓度洗涤液；(3) 样品预处理预处理板上每孔按1: 2的比例加入预处理液和样品，56'C振 荡孵育30分钟，待用；(4) 加样取96或48孔化学发光酶标板，预设置空内、阴性、阳性对照各3孑L, 空白对照每孔加入100u 1样品稀释液，其余孔每孔中先加入50u 1样品稀释液，然后 阴、阳性对照孔每孔加入50y 1相应对照血清，剩余孔样品检测孔，将经上述预处理的各待测样品按设定每孔中加入50nl;加样完毕后用不干胶封片封盖反应板，37'C振荡 孵育60分钟；(5) 洗板甩去板孔中的液体，在吸水纸上拍干；用工作浓度洗涤液洗板6次， 最后拍干；(6) 加酶每孔中加入100ii 1抗HCV-cAg酶结合物，用不干胶封片封盖反应板， 37。C孵育30分钟；(7) 洗板同步骤(5);(8) 加底物每孔中先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50y 1，避光显色至少2分钟；(9) 测定显色反应后，将酶标板置化学发光仪上测出各孔相对发光度(RLU);(10) 以阴性对照发光度(RLU)的平均值+2500为临界值(CUTOFF);待检样品的 RLU值〉临界值(CUTOFF)为阳性，待测样品RLU值〈临界值(CUTOFF)为阴性为判 定标准进行判定。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点通常当HCV感染者体内出现HCV抗体并逐渐增加后，血清(或血浆)中的游离抗原量 将随时间延长而逐渐降低甚至无法检出，因此限制了HCV核心游离抗原检测试剂对HCV后 期诊断的临床应用。本专利技术的HCV核心抗原化学发光检测试剂盒以HCV核心抗原酶联免疫 试剂盒为基础，在原有检测程序基础上加入对血清(或血浆)样品进行预处理的过程， 该步骤不但消除了抗体分子和血清(或血浆)样本中类风湿因子、补体相关蛋白对检测 结果的非特异性影响，关键是能使感染者血清(或血浆)中形成的自身HCV抗原/抗体复 合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的抗ＨＣＶ－ｃＡｇ酶结合物、ＨＣＶ核心抗原标准品梯度溶液、阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、ＨＣＶ－ｃＡｇ样品稀释液、化学发光底物液Ａ、化学发光底物液Ｂ、２０×浓缩洗涤液及不干胶封片和使用说明书；其特征在于，所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯９６或４８孔化学发光酶标板，且其各孔包被有浓度为５ｕｇ／ｍｌ的包被抗体Ｍａｂ１和Ｍａｂ２；所述抗ＨＣＶ－ｃＡｇ酶结合物是辣根过氧化酶标记的羊抗兔的Ｍａｂ３和Ｍａｂ４抗体；所述标准品溶液为５个浓度梯度，分别是：２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ；预处理液为体积比０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、重量比１．５％ＳＤＳ和０．１Ｍ、ｐＨ８．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ的混合液；化学发光底物液Ａ是３．０ｍｍｏｌ／Ｌ鲁米诺与０．３ｍｍｏｌ／Ｌ对碘苯酚的混合液，化学发光底物液Ｂ为７．５ｍｍｏｌ／Ｌ的双氧水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱之炜，盖中涛，卢志明，宿振国，郭琴燕，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]