本发明专利技术公开了一种抗体标记信号放大方法，技术方案是：（１）称取低熔点琼脂糖０．１ｇ，溶于纯化水，水浴溶解后，加入新配０．１Ｍ ＮａＩＯ↓［４］水浴反应４５～１２０分钟后，加入９～１５ｍｌ无水乙醇，沉淀析出后，离心５～２０分钟，去上清后加入纯化水清洗沉淀，重复操作２次，清洗结束后，加入纯化水水浴溶解沉淀，制成溶液Ａ；（２）量取待标记抗体，用ＮａＯＨ调ｐＨ至８．６～９．６，加入１００～５００ｕｌ溶液Ａ，搅拌均匀后，３７℃反应３０～６０分钟，制成溶液Ｂ；（３）称取Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）溶解于蒸馏水中，溶解后，加入１新配的０．１Ｍ ＮａＩＯ↓［４］溶液，避光反应１０～３０分钟后，加入新配乙二醇避光反应８～１５分钟后，制成溶液Ｃ；（４）将溶液Ｂ与溶液Ｃ按体积比１∶１～１∶３混合，避光反应２５～４５分钟后，加入等体积的醛基封闭液反应１５－３０分钟，然后将所有溶液装入透析袋中，用１ｍＭ ｐＨ８．０的磷酸缓冲液避光透析１２～２４小时，透析结束后将标记抗体从透析袋中取出。可将检测下限提高到１０↑［－１８］ｍｏｌ／Ｌ以下。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于免疫分析
技术介绍
免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗 原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体 的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物 进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用，但作为标记抗体用的酶应满足下列要求(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测 定。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量 小，纯酶容易制备，所以最常用。目前应用HRP标记抗体技术的检测方法检测下 限可达l(T"mol/L，但仍无法满足检测要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:提供一种实现可使检测下限达到10—18moI/L 以下的辣根过氧化物酶标记抗体信号放大方法。 本专利技术的技术方案是(1) 、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化水，45 5(TC水浴溶解后，加 入新配0.1MNalO4 5 10ml， 50 60。C水浴反应45 120分钟后，加入9 15ml 无水乙醇，沉淀析出后，8000 12000rpm离心5 20分钟，去除上清溶液后加 入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作2次，清洗结束后，加入50ml纯化水45 5(TC水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2) 、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至8.6 9.6，加入100 500ul 溶液A，搅拌均匀后，37'C反应30 60分钟，制成溶液B;(3) 、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，完全溶解后，加入 100 200ul新配的0.1MNalO4溶液，30 37。C避光反应10 30分钟后，加入现配的10%乙二醇10 20ul, 30 37。C避光反应8 15分钟后，制成溶液C;(4)、将溶液B与溶液C按体积比1: 1 1: 3混合，30 37。C避光反应25 45分钟后，加入等体积的醛基封闭液30 37'C反应15-30分钟，然后将混合后 溶液装入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸缓冲液避光透析12 24小时，透析结 束后将混合后溶液从透析袋中取出。有益效果:本专利技术的抗体标记信号放大方法，先通过用Nal04将琼脂糖的羟基 氧化成醛基，利用琼脂糖氧化后含多位点醛基的特点，在碱性条件下将待标记抗 体交联起来，然后再将交联抗体进行HRP标记，起到了信号放大作用，在同样抗 原浓度条件下，获得5-10倍的信号放大。本专利技术提供的信号放大方法，可通过用 低熔点琼脂糖经氧化后交联标记抗体达到信号放大效果，可将检测下限提高到 10"8mol/L以下。 具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本专利技术的具体实施方式。 实施例l(1)、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化水，45。C水浴溶解后，加入新 配0.1MNalO4 5ml，50。C水浴反应45分钟后，加入9ml无水乙醇，沉淀析出后， 8000rpm离心5分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作2 次，清洗结束后，加入50ml纯化水45'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2) 、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至8.6，加入100ul溶液A,搅 拌均匀后，37'C反应30分钟，制成溶液B;(3) 、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，完全溶解后，加入 100ul现配的0.1M Nal04溶液，3(TC避光反应10分钟后，加入新配10%乙二醇 10ul， 3(TC避光反应8分钟后，制成溶液C;(4)、将溶液B与溶液C按体积比1: l混合，3(TC避光反应25分钟后，加 入等体积的醛基封闭液3(TC反应15分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用 lmMPH8.0的磷酸缓冲液避光透析12小时，透析结束后将混合后溶液从透析袋 中取出。 实施例2(1)、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化7K， 45'C水浴溶解后，加入新配0.1MNalO4 6ml,5(TC水浴反应65分钟后，加入10ml无水乙醇，沉淀析出后， 9000ipm离心8分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作2 次，清洗结束后，加入50ml纯化水45'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2) 、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至8.8，加入180ul溶液A,搅 拌均匀后，37X:反应34分钟，制成溶液B;(3) 、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，完全溶解后，加入 128ul现配的0.1M Nal04溶液，32。C避光反应14分钟后，加入新配10%乙二醇 12ul， 32'C避光反应IO分钟后，制成溶液C;(4) 、将溶液B与溶液C按体积比1: l混合，32'C避光反应31分钟后，加 入等体积的醛基封闭液32'C反应18分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用 lmMPH8.0的磷酸缓冲液避光透析15小时，透析结束后将混合后溶液从透析袋 中取出。实施例3(1)、称取低熔点琼脂糖O.lg，溶于10ml纯化水，48'C水浴溶解后，加入 新配O,IM NaI04 7ml，54。C水浴反应82分钟后，加入llml无水乙醇，沉淀析出 后，9800rpm离心12分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操 作2次，清洗结束后，加入50ml纯化水48'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2) 、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至9.0，加入280ul溶液A，搅 拌均匀后，37'C反应40分钟，制成溶液B;(3) 、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，完全溶解后，加入 144ul现配的0.1M Nal04溶液，34。C避光反应18分钟后，加入新配10%乙二醇 14ul， 34'C避光反应IO分钟后，制成溶液C;(4) 、将溶液B与溶液C按体积比1: 2混合，34。C避光反应35分钟后，加 入等体积的醛基封闭液3fC反应20分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用 lmMPH8.0的磷酸缓冲液避光透析18小时，透析结束后将混合后溶液从透析袋 中取出。实施例4(1)、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化水，48'C水浴溶解后，加入新 配0.1MNalO4 8ml，54。C水浴反应90分钟后，加入12ml无水乙醇，沉淀析出后，10800rpm离心16分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作 2次，清洗结束后，加入50ml纯化水48'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2) 、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至9.2，加入320ul溶液A，搅 拌均匀后，37'C反应44分钟，制成溶液B;(3) 、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，完全溶解后，加入 168ul新配的0.1M Nal04溶液，37。C避光反应22分钟后，加入新配10%乙二醇 16ul， 37i:避光反应12分钟后，制成溶液C;(4) 、将溶液B与溶液C按体积比1: 2混合，37。C避光反应38分钟后，加 入等体积的醛基封闭液37'C反应23分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用 lmM PH8.0的磷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体标记信号放大方法，其特征在于，包括如下步骤： （１）、称取低熔点琼脂糖０．１ｇ，溶于１０ｍｍｉｎｌ．ｇｉｆ纯化水，４５～５０℃水浴溶解后，加入新配０．１ＭＮａＩＯ４ ５～１０ｍｍｉｎｌ．ｇｉｆ，５０～６０℃水浴反应４５～１２０ 分钟后，加入９～１５ｍｍｉｎｌ．ｇｉｆ无水乙醇，沉淀析出后，８０００～１２０００ｒｐｍ离心５～２０分钟，去除上清溶液后加入１０ｍｍｉｎｌ．ｇｉｆ纯化水清洗沉淀，重复操作２次，清洗结束后，加入５０ｍｍｉｎｌ．ｇｉｆ纯化水４５～５０℃水浴溶解沉淀，制成溶液Ａ； （２）、量取待标记抗体５ｍｇ，用ＮａＯＨ调ｐＨ至８．６～９．６，加入１００～５００ｕｍｉｎｌ．ｇｉｆ溶液Ａ，搅拌均匀后，３７℃反应３０～６０分钟，制成溶液Ｂ； （３）、称取５ｍｇ辣根过氧化物酶溶解于１ｍｍｉｎｌ ．ｇｉｆ蒸馏水中，完全溶解后，加入１００～２００ｕｍｉｎｌ．ｇｉｆ新配的０．１ＭＮａＩＯ↓［４］溶液，３０～３７℃避光反应１０～３０分钟后，加入新配１０％乙二醇１０～２０ｕｍｉｎｌ．ｇｉｆ，３０～３７℃避光反应８～１５分钟后，制成溶液Ｃ； （４）、将溶液Ｂ与溶液Ｃ按体积比１∶１～１∶３混合，３０～３７℃避光反应２５～４５分钟后，加入等体积的醛基封闭液３０～３７℃反应１５－３０分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用１ｍＭ ＰＨ８．０的磷酸缓冲液避光透析１２～２４小时，透析 结束后将混合后溶液从透析袋中取出。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴堂明，潘能科，陆冬雷，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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