一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管作为检测抗体标记物，实现了鳞状细胞癌标志物SCCA的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对鳞状细胞癌的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Preparation method and application of squamous cell carcinoma marker sandwich heart type immunosensor

The invention belongs to the technical field of novel functional materials and biological sensing detection, and provides a preparation method and application of a squamous cell carcinoma marker and a sandwich type immunosensor. The sea urchin like Au PD @ MoS2 doped sulfonated amino carbon nanotubes as detection antibody marker, detection of the squamous cell carcinoma marker SCCA, has strong specificity, high sensitivity, low detection limit, it has important scientific significance and application value of detection of squamous cell carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于免疫分析和生物传感
，提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用。
技术介绍
血清中各种肿瘤标志物的灵敏测定对癌症的早期诊断起着重要的作用；肿瘤标志物的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，因此建立快速、灵敏准确检测肿瘤标志物的分析方法成为了当今的研究热点，引起了大家的广泛关注。。目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。随着纳米技术的发展，各种纳米粒子广泛的应用于传感器的构建过程中。氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团，且具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效吸附固载抗体；负载金纳米粒子的石墨烯具有更好的导电性；二硫化钼是类石墨烯材料，具有很好的催化性能，氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管不仅具有碳纳米管及二硫化钼的优良性能，而且经过磺化、氨基化可以使其固载更多的抗体，大大增加测定的灵敏度；海胆状金钯具有大比表面积，不仅可以起固定抗体，防止碳纳米管堆叠的作用，而且枝晶状的钯纳米材料大大增加了与过氧化氢的接触面积，提高了对过氧化氢的催化效果，因此，海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管对过氧化氢的催化作用呈多重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用，实现了对鳞状细胞癌标志物的超灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器应用于鳞状细胞癌标志物的高灵敏、特异性检测。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~2.0mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6µL、5~15µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（4）继续将3µL、1.5~3.0mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005~50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；（5）将6µL、2.0~3.0mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。2.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述Au@GS的制备，步骤如下：取8~16mg氧化石墨烯溶解在10mL的超纯水中，超声50~70min，依次加入200µL、质量分数为1%的HAuCl4，20µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应8~12h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥10~14h，制得Au@GS；所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。3.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：(1)氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备将0.5~1.5g碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60mL的浓硫酸和20mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥10~14h，制得磺化碳纳米管；将4~8mg上述磺化碳纳米管和15~30mg(NH4)2MoS4溶解在15~30mL二甲基甲酰胺中，超声30min后，在210℃条件下反应18h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次，60℃下干燥24h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；将0.1~0.3g上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10mL无水乙醇中超声10min，在搅拌条件下缓慢加入0.1~0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃下搅拌反应1.5~2h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次，60℃下干燥24h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；(2)海胆状金钯纳米粒子的制备将1~2mL、质量分数为1%的HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30min，然后加入10mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热20~30min后，制得金纳米粒子溶液；取10mL金纳米粒子溶液在8000~10000rpm条件下，离心6~10min，将所得沉淀物分散在10mL含0.05moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10mL超纯水中备用；将上述分散好的10mL溶液和40~60mL1mmoL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100mL的圆底烧瓶中，超声1~3min，加入10~15mL、10mmoL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置10~30s，静置6h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h,制得海胆状金钯纳米粒子；将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；(3)海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备将20~30mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入20~40mL、1mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1h，过滤，室温下干燥20~24h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；将4~6mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到1~2mL超纯水中，加入100μL、80~120μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900μL、50mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4˚C下，6000rpm转速下离心10~15min，得到下层沉淀物，加入1mL、50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器，用于鳞状细胞癌标志物的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.10~7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1） 将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al

【技术特征摘要】
1.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~2.0mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6µL、5~15µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（4）继续将3µL、1.5~3.0mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005~50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；（5）将6µL、2.0~3.0mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述Au@GS的制备，步骤如下：取8~16mg氧化石墨烯溶解在10mL的超纯水中，超声50~70min，依次加入200µL、质量分数为1%的HAuCl4，20µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应8~12h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥10~14h，制得Au@GS；所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。3.如权利要求1所述的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：(1)氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备将0.5~1.5g碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60mL的浓硫酸和20mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥10~14h，制得磺化碳纳米管；将4~8mg上述磺化碳纳米管和15~30mg(NH4)2MoS4溶解在15~30mL二甲基甲酰胺中，超声30min后，在210℃条件下反应18h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次，60℃下干燥24h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；将0.1~0.3g上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10mL无水乙醇中超声10min，在搅拌条件下缓慢加入0.1~0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃下搅拌反应1.5~2h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次，60℃下干燥24h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，高增强，吕慧，张晓波，李法瀛，姜丽萍，王平，董云会，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37