一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测重症肌无力（MG）标志物乙酰胆碱受体抗体（AchR‑Ab）的电化学发光试剂盒及制法，制备的试剂盒包括：生物素标记的乙酰胆碱受体（AchR）工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG工作液，链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，AchR‑Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液，试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，特异性优异，准确性好，可以实现乙酰胆碱受体抗体的准确定量。

Preparation of electrochemiluminescence kit for detection of acetylcholine receptor antibody (AChR AB)

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)的电化学发光试剂盒的制备
本专利技术涉及一种用于检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)的电化学发光试剂盒及制备方法，属于电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的免疫测定

技术介绍
重症肌无力(MG)是一种由自身抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与，主要导致横纹肌神经-肌肉接头处信号传导障碍的自身免疫性疾病。其特点是发病年龄广、致残率高、易复发、预后差，严重威胁到人类健康；据统计，MG全球患病率为每100万人群中有15～300人患病，年发病率为(8.0～20.0)/100万[1]。MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR)。乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)作为MG疾病的检测指标，AchR-Ab大多数为IgG1和IgG3亚型，可以激活补体级联反应，攻击突触后膜组分，导致AChR降解和结构改变，使突触后膜受体数目减少[6]。AchR-Ab血清含量与临床症状的严重程度不成正比[7]，对此现象可能的解释是MG的肌无力症状主要由受体数目的减少导致，其不仅受自身抗体滴度的影响，还与抗体的类型或其他因素有关系。据文献报道，MG的发病与肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)等也密切相关[2-3]。MG患者治疗前的血清AchR-Ab含量与治疗前的肌无力绝对评分、患病严重程度不具有明显相关性，但治疗后的血清AchR-Ab浓度和治疗后的肌无力绝对评分呈正相关[4]，表明AchR-Ab血清含量变化对治疗效果有重要的指导意义。有研究表明，AchR-Ab和MuSK-Ab双阳性MG患者病情可能更严重，更易出现肌无力现象，胸腺增生性病变发生率较高，胸腺切除术可能有效。AchR-Ab阳性患者多数伴有胸腺异常[5]。AchR-Ab是一种多克隆抗体，多数属于抗α-银环蛇毒素(α-bunga-rotoxin，α-BGT)结合部的抗体，主要为IgG型，不同类型的MG患者血清中AchR-Ab具有不同性质。准确测定其浓度对于MG病人的分型及后续治疗和监控都具有重要意义。目前最主要的测定方法就是酶联免疫法(ELISA)。其检测重症肌无力患者血清，AchR-Ab阳性率约为70％，然而由于ELISA方法所固有的操作繁琐，重复性差等缺点，很难获得准确的定量结果。不能满足重症肌无力患者病况监控，治疗跟踪等需要。磁珠法电化学发光(ECL)技术是一种灵敏度更高，重现性更好，测定范围更宽广，操作更简便的检测方法[8]。已经成功应用于肿瘤标志物，激素等百余种指标的检测。开发用于检测AchR-Ab浓度的电化学发光试剂盒可大幅度提升AchR-Ab检测的效果和效率，具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有快速、准确地定量检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒及制法。本专利技术技术方案如下：一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒，所述试剂盒成分包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的AchR抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液，以及AchR-Ab校准品和/或质控品。(1)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中AchR抗原为外购的商用AchR抗原。(2)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(TritonX-100)和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。(3)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中生物素标记的AchR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的Brij35和/或TritonX-100和/或Tween20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。(4)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中AchR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或TritonX-100和/或Tween20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。(5)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中清洗液为pH为13以上，浓度为0.1～0.5mol/L的KOH液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。(6)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L的三丙胺、0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。本专利技术还提供一种上述检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的AchR抗原工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，清洗液和电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。优选地，所述生物素标记的AchR抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与AchR抗原按照1～20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析除去多余的生物素，得生物素标记的AchR抗原。优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗人IgG抗体与Ru-NHS酯的质量比为5～20:1，37℃避光反应1～3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒，其特征在于用于检测试剂的制备，包括：(1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，(2)生物素标记的AchR抗原工作液，(3)三联吡啶钌标记的抗人IgG工作液，(4)AchR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，(5)清洗液以及含三丙胺的电化学发光底物液。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒，其特征在于用于检测试剂的制备，包括：(1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，(2)生物素标记的AchR抗原工作液，(3)三联吡啶钌标记的抗人IgG工作液，(4)AchR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，(5)清洗液以及含三丙胺的电化学发光底物液。


2.根据权利要求1所述的检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于(1)中所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8~7.6，浓度为0.01~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05~2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02~1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05~0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。


3.根据权利要求1-2任一项所述的检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于(2-3)中所述生物素标记的AchR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5~5wt％的牛血清白蛋白、0.5~5wt％的氯化钠、1~5wt％的蔗糖、0.05~2wt％的小牛血清、0.02~1wt％的酪蛋白、0.02~1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05~0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。


4.根据权利要求1-3任一项所述的检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于(4)中所述AchR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5~5wt％的牛血清白蛋白、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32