本发明专利技术涉及一种新型的从血液中检测乙酰胆碱酯酶抗体（AChE‑Ab）的电化学发光试剂盒及其制备方法。制备的试剂盒包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的AChE抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，AChE‑Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素生物反应信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中AChE‑Ab的准确定量检测。
Electrochemiluminescence kit for the detection of ache AB and its preparation
【技术实现步骤摘要】
检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及其制法
本专利技术涉及一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析
技术介绍
重症肌无力(myastheniagravis,MG)是一种自身免疫性疾病，它是一种自身抗体介导、补体参与、细胞免疫依赖的神经肌肉接点(NMJ)处神经递质的信号传递障碍。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR)。但抗AChR抗体并非存在于所有的MG患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无关。乙酰胆碱(ACh)是一种神经递质，主要在运动神经终末处合成，其作用为传导神经冲动。乙酰胆碱酯酶(AChE)广泛分布于人的神经组织，其主要功能是催化胆碱能神经末梢释放的ACh的水解，维持正常的神经活动。任何一种因素影响到突触结构都会导致胆碱能神经元功能的不完整，如抗乙酰胆碱酯酶抗体(AChE-Ab)与突触部位的AChE结合，造成AChE失活，阻碍ACh水解，ACh持续作用于突触后膜，使突触后膜处于去极化状态不能恢复，而影响下一次的神经活动的传递[2]。Lennon等发现将AChE作为靶抗原，把抗乙酰胆碱酯酶的抗体注入大鼠体内，通过组织化学及形态学检查，发现AChE活性降低引发了临床症状的产生[3]。MG患者中有13％血清中为AChE-Ab阳性，且多为AChR-Ab阴性，临床多见眼肌型MG[4]。目前AChE-Ab的主要检测方法还是ELISA检测，该方法具有灵敏度低，重现性差，操作繁琐等多个缺点。建立高灵敏度、高特异性的检测AChE-Ab方法是尚待解决的问题。电化学发光免疫分析法是继酶联免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析之后的新一代标记免疫测定技术，具有高度敏感、特异性强、测定范围宽、试剂稳定、操作简单等优点。目前尚未有文献报道电化学发光免疫分析法检测AChE-Ab的研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测AChE-Ab的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及制法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的AChE工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，AChE-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的BSA(牛血清白蛋白)和/或酪蛋白、0.05～1wt％的Brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)和/或TritonX-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)和/或Tween-20(山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚)、0.05～0.5wt％的proclin300或叠氮化钠。优选地，所述抗人IgG抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。优选地，所述生物素标记的AChE抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％氯化钠、1～5wt％蔗糖、0.05～2wt％小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的Brij-35和/或TritonX-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。优选地，所述检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒还包括AChE-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述AChE-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、0.02～1wt％的Brij-35和/或TritonX-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L三丙胺、0.01～2wt％的Brij-35和/或TritonX-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。优选地，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。本专利技术还提供一种上述检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的AChE工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。优选地，所述生物素标记的AChE抗原的制备方法为：将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化的生物素与AChE按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的AChE。优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将Ru-NHS(NHS活化的三联吡啶钌)与pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中AChE-Ab的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的AChE-Ab，使检测更快速、更可靠、更稳定。具体实施方式现在对本专利技术作进一步详细的说明。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测抗人乙酰胆碱酯酶抗体（AChE-Ab）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的AChE抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，AChE-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测抗人乙酰胆碱酯酶抗体（AChE-Ab）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的AChE抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，AChE-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体（即第二抗体）为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。
3.根据权利要求1所述的检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8~7.6，浓度为0.01mol/L~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05~1wt%的牛血清白蛋白（BSA）和/或酪蛋白、0.05~1wt%的Brij-35（月桂醇聚氧乙烯醚）和/或TritonX-100（聚乙二醇对异辛基苯基醚）和/或Tween-20（山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚）、0.05~0.5wt%的proclin300或叠氮化钠。
4.根据权利要求1所述的检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的AChE抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01mol/L~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5~5wt%牛血清白蛋白、0.5~5wt%氯化钠、1~5wt%蔗糖、0.05~2wt%小牛血清、0.02~1wt%酪蛋白、0.02~1wt%的Brij-35和/或TritonX-100和/或Tween-20、0.05~0.5wt%proclin300和/或叠氮化钠。
5.根据权利要求1所述的检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒还包括AChE-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述AChE-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01mol/L~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：卜梅杰，泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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