一种检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体的芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种能够同时检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体浓度的蛋白芯片，所述芯片通过如下步骤制得：（1）黑玻片预处理；（2）点样特异性抗原组分溶液；（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。本发明专利技术芯片用于检测病人的血液中呼吸道感染病原体IgM抗体的浓度，为临床呼吸道病原鉴别诊断提供导向性依据。本方法形成的试剂盒实现了呼吸道感染的早期、快速、准确诊断，而且还可以实现呼吸道感染病原体IgM抗体检测的全自动化操作。

A chip for detecting IgM antibody of nine pathogens of respiratory tract infection and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体的芯片及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体浓度的芯片及其制备方法。
技术介绍
呼吸道感染在临床上具有较高的发病率，主要诱因为细菌等病原体感染。临床资料证实，超过90％的上呼吸道感染患者发病原因为病毒感染[1-2]。该病病原学比较复杂，并且具有季节流行特征。诱发呼吸道感染的病原菌种类多样，例如病毒、衣原体、支原体等[3-4]。当前人类生活环境的持续恶化使得病原微生物毒性与病原性随之变化，加上临床上多种抗生素应用范围的拓宽，细菌性感染率有所下降，但病毒性感染率却有所上升，病原体感染所占比例也发生了变化，提升了用药准确、对症治疗的难度[5-6]。检测这些病原体有很多方式，例如分离培养、PCR等[7-8]。呼吸道感染，尤其是下呼吸道感染的诊断通常使用实验室检查的方式，但并不能达到预期目标。分离培养的方式过去虽然被大多数临床工作者认可，但需要花费较长的培养时间，并具有较高的技术难度，已经被分子生物学的检测方式取代[9-10]。但分子生物学需要较高的实验室条件，不能实现大多数的病原菌检测[11-12]。当前血清学检测操作便捷、经济，使用范围逐渐拓宽[13]。已报道的上呼吸道感染的病原体有很多，其中最常见的有：嗜肺军团菌人最易感染的是嗜肺军团菌血清1型，非典型性肺炎常伴随有全身症状。10％的肺炎是由嗜肺军团菌血清1型引起的。肺炎支原体肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，会引起发热和严重上呼吸道感染，一般抗生素治疗无效。Q热立克次体Q热是由Q热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎。肺炎衣原体肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。在老年人中发病率较高，它所引起的肺炎占所有肺炎病例的10％。腺病毒腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和轻度呼吸道感染。呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发流行。流感病毒它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。由于它易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。因此，实验室诊断就显得非常重要。副流感病毒副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎(哮喘)。3型具有流行性，1和2型具有地域性。目前市场上已存在的呼吸道感染IgM九项联检试剂盒的方法学以间接免疫荧光法为主，需要借助免疫荧光显微镜观察结果，存在着通量低、灵敏度低和自动化程度低的缺陷。难以及时为呼吸道疾病的诊断提供依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种一次性检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体的芯片及其制备方法。本专利技术芯片用于检测呼吸道感染病原体IgM抗体，检出率高，无痛苦，无危险性，成本低，操作简便，只需少量血就可检测许多个项目，并且还实现了呼吸道感染病原体IgM抗体检测的全自动化操作。本专利技术的技术方案如下：本专利技术所述芯片通过如下步骤制得：(1)黑玻片预处理；(2)点样特异性抗原组分溶液；(3)对芯片进行封闭，制得所述芯片。步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8次；②将黑玻片置于质量浓度为0.05～1wt％的硅烷溶液中浸泡20～60min；③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。步骤(2)中所述抗原组分溶液包括嗜肺军团菌血清1型、McCoy细胞中的肺炎支原体、Q热立克次体II期、肺炎衣原体(原生小体)、HEp-2细胞中的腺病毒、HEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒、LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒、LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒、LLC-MK2细胞中副流感病毒1、2和3型的特异性抗原组分溶液、阳性质控和阴性质控。步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样，在黑玻片上点成4×12的矩阵；每列为同一阳性质控、阴性质控和特异性抗原溶液形成的点。步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～4h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。一种所述芯片的应用，将所述芯片制成试剂盒。所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶的山羊抗人IgM抗体溶液、检测液A和检测液B。所述检测液A含有1％鲁米诺和2％Tris，检测液B含有1％过氧化氢。本专利技术的检测基本原理为：本专利技术产品检测呼吸道感染病原体IgM抗体的免疫学方法为间接法，将其中的特异性抗原按照特定的点阵列用微量液体分配器固定于载体基质上，这些特异性抗原可以捕获被测样本中的IgM，被捕获的IgM又可以和标记有辣根过氧化物酶或碱磷酶的山羊抗人IgM抗体相结合，辣根过氧化物酶或碱磷酶催化化学发光底物，其光信号通过CCD摄像头采集，并进行智能分析。根据信号浓度定量曲线，通过光信号的强弱计算被测样本中微生物的浓度。本专利技术有益的技术效果在于：本方法是首次的集约式，高通量地同时检测多个呼吸道感染病原体IgM抗体的化学发光法。本技术利用化学发光技术获得了高度的灵敏度。本方法还有一个巨大优点是可以利用全自动化的芯片阅读仪，实现高速，简便的检测，比其他需要大量手工操作的方法更加适合医院大量开展。本专利技术与国外进口试剂(比尔塞有限公司VIRCELL,S.L.)相比，呼吸道感染病原体IgM抗体的检出率高度一致，性能良好。附图说明图1为本专利技术制备方法中特异性抗原组分点样示意图。图中，列1：阳性质控列；列2空白；列3：嗜肺军团菌血清1型；列4：McCoy细胞中的肺炎支原体；列5：Q热立克次体II期；列6：肺炎衣原体(原生小体)；列7：HEp-2细胞中的腺病毒；列8：cHEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒；列9：LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒；列10：LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒；列11：LLC-MK2细胞中副流感病毒1、2和3型；列12：阴性质控列。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。实施例1一种检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体的芯片，所述芯片通过如下步骤制得：(1)黑玻片预处理；①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯化水清洗2～8次；②将黑玻片置于质量浓度为1wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0.2h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种实现呼吸道感染的早期，快速，准确的诊断芯片，可以一次性检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体，其特征在于所述芯片通过如下步骤制得：/n（1）黑玻片预处理；/n（2）点样特异性抗原组分溶液；/n（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。/n

【技术特征摘要】
1.一种实现呼吸道感染的早期，快速，准确的诊断芯片，可以一次性检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体，其特征在于所述芯片通过如下步骤制得：
（1）黑玻片预处理；
（2）点样特异性抗原组分溶液；
（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。


2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：
①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h，之后采用纯化水清洗2~8次；
②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1wt%的硅烷溶液中浸泡20~60min；
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。


3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（2）中所述特异性抗原组分溶液包括嗜肺军团菌血清1型、McCoy细胞中的肺炎支原体、Q热立克次体II期、肺炎衣原体（原生小体）、HEp-2细胞中的腺病毒、HEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒、LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒、LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒、LLC-MK2细胞中副流感病毒1、2...

【专利技术属性】
技术研发人员：成舜，泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32