一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用。所述还原剂缓冲液包括：10‑100mM三(2‑羧乙基)膦、2‑10mM螯合剂和10‑100mM缓冲剂。所述还原剂缓冲液中三(2‑羧乙基)膦和螯合剂相互配合，协调作用，减少待测样品中干扰物质的影响，使得检测结果更加灵敏，特异性更高，同时所得缓冲液受温度和浓度的影响小，稳定性较好，进而能够提高检测结果的准确性。本发明专利技术提供的还原剂缓冲液特异性和灵敏度较高，性质稳定且制备方法简单，对环境友好，因此可用来制备检测试剂盒，所得检测试剂盒易于操作，检测结果准确可靠。

A reducing buffer and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术分子检测领域，具体涉及一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于检测乙型肝炎病毒核心抗体的还原剂缓冲液及其制备方法和应用。
技术介绍
乙型肝炎(简称乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的能导致肝性炎症及肝功能损害的一种传染性疾病。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是乙肝病毒的核心部分，存在于Dane颗粒的核心，可刺激人T淋巴细胞产生乙型肝炎病毒核心抗体。目前乙肝病毒血清学检查项目一般包括HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc，即俗称的“乙肝两对半”。HBV感染者发病不久后便会产生HBcAg抗体，这种抗体常常终身携带。在HBV感染康复者，Anti-HBc可持续存在，因此Anti-HBc筛查可用于确定既往感染的个体。Anti-HBc检测联合其它乙型肝炎检测有助于HBV感染的诊断和监测。在其他乙型肝炎标志物缺乏的情况下，Anti-HBc可能是提示存在HBV感染的唯一指标。主流的检测Anti-HBc的方法有酶联免疫(ELISA)、胶体金法、化学发光(GLIA)、电化学发光(ECL)和时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等。由于存在大量标本在没有其他肝炎标记物的存在、也没有疾病症状的情况下只对Anti-HBc呈阳性，而且该标志物和疾病之间的流行病学联系不强，因此在进行Anti-HBc检测时容易导致误判。因此，区分样本是否是假阳性标本是很重要的。为了提高检测结果的特异性和灵敏度，在样品检测前需要使用还原剂缓冲液对样品进行处理，以消除样品中的干扰物质的非特异性结合，避免出现假阳性结果，提高检测结果的准确性，现有的还原剂缓冲液抗氧化能力弱，易被空气氧化，而且部分带有刺激性气味，具有一定的毒性。CN102146487A公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，该试剂盒中用于除去干扰物质的溶液配方为1mM乙二胺四乙酸、0.5％SDS、10mM，pH8.0的Tris-HCl和0.1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)；同时该专利技术采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。然而所述配方的溶液抗氧化能力弱，处理样品时样品容易被氧化，导致结果不准确。因此，提供一种安全无毒、性质稳定且能够消除样本中干扰物质的还原剂缓冲液是检测乙型肝炎病毒核心抗体时急需解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种稳定性好、对环境友好的还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液稳定性较好，不仅可以消除样本中的干扰物质，提高免疫试剂的特异性，增加检测结果的准确性和可靠性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种还原剂缓冲液，包括：10-100mM三(2-羧乙基)膦、2-10mM螯合剂和10-100mM缓冲剂。本专利技术提供的还原剂缓冲液，使用三(2-羰基乙基)磷(TCEP)、螯合剂与缓冲液以合理的配比进行制备，其中TCEP毒性较小且易溶于水，对还原二硫键选择性极强，使用TCEP配制的还原剂缓冲液在处理目标样品时更容易操作；同时TCEP与特定的螯合剂配合使用，会使缓冲液具有较高的稳定性，使其受温度和浓度的影响小，且能够在更宽的pH值范围包括酸性条件(例如pH为3)下使用，从而有效减少酰胺键的水解，进而减少目标样品中干扰物质的影响，因此使用本专利技术提供的还原剂缓冲液，能够使检测结果更加灵敏和准确。本专利技术中，所述三(2-羧乙基)膦的浓度为10-100mM，例如可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM等。所述螯合剂浓度为2-10mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM等。所述缓冲剂浓度为10-100mM，例如可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM等。作为本专利技术优选的技术方案，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸或葡萄糖酸中的任意一种或两种以上的组合，优选为乙二胺四乙酸和/或葡萄糖酸，进一步优选为葡萄糖酸。本专利技术中使用乙二胺四乙酸或葡萄糖酸为螯合剂时，制备得到的还原剂缓冲液受温度和浓度的影响更小，说明TCEP与乙二胺四乙酸或葡萄糖酸配合使用时，两者之间存在协同作用，能够明显提高缓冲液的稳定性。优选地，所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(Mopso)、3-吗啉丙磺酸(Mops)或脂肪酸甲酯磺酸盐(MES)中的任意一种或两种以上的组合。优选地，所述还原剂缓冲液的pH为6-8，例如可以是6、6.2、6.4、6.5、6.8、7、7.2、7.4、7.5、7.8、7.9或8等。作为本专利技术优选的技术方案，所述还原剂缓冲液还包括0.1-200mM(例如可以是0.1mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、50mM、80mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、190mM或200mM等)的无机盐。优选地，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾中的任意一种或两种以上的组合。作为本专利技术优选的技术方案，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％等)的表面活性剂。优选地，所述表面活性剂选自吐温(Tween)，十二烷基硫酸钠(SDS)或曲拉通(Triton)中的任意一种或两种以上的组合。作为本专利技术优选的技术方案，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％等)的防腐剂。优选地，所述防腐剂选自Proclin300、叠氮钠二唑烷基脲、咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸或金刚烷季铵中的任意一种或两种以上的组合。作为本专利技术优选的技术方案，所述还原剂缓冲液包括：10-100mM三(2-羧乙基)膦、2-10mM乙二胺四乙酸和/或葡萄糖酸、10-100mM缓冲剂、0.1-200mM无机盐、质量浓度为0.1-0.5％的表面活性剂和质量浓度为0.1-0.5％的防腐剂。第二方面，一种如第一方面的还原剂缓冲液的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将配方量的缓冲剂、螯合剂和水混合均质，得到均质液；(2)将三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入所述均质液中乳化并调节pH；(3)加入防腐剂和表面活性剂后搅拌均匀，出料，得到所述还原剂缓冲液。...

【技术保护点】
1.一种还原剂缓冲液，其特征在于，所述还原剂缓冲液包括：10-100mM三(2-羧乙基)膦、2-10mM螯合剂和10-100mM缓冲剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种还原剂缓冲液，其特征在于，所述还原剂缓冲液包括：10-100mM三(2-羧乙基)膦、2-10mM螯合剂和10-100mM缓冲剂。


2.根据权利要求1所述的还原剂缓冲液，其特征在于，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸或葡萄糖酸中的任意一种或两种以上的组合，优选为乙二胺四乙酸和/或葡萄糖酸，进一步优选为葡萄糖酸；
优选地，所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸盐、3-吗啉丙磺酸或脂肪酸甲酯磺酸盐中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述还原剂缓冲液的pH为6-8。


3.根据权利要求1或2所述的还原剂缓冲液，其特征在于，所述还原剂缓冲液还包括0.1-200mM的无机盐；
优选地，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾中的任意一种或两种以上的组合。


4.根据权利要求1-3任一项所述的还原剂缓冲液，其特征在于，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％的表面活性剂；
优选地，所述表面活性剂选自吐温、十二烷基硫酸钠或Triton中的任意一种或两种以上的组合。


5.根据权利要求1-4任一项所述的还原剂缓冲液，其特征在于，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％的防腐剂；
优选地，所述防腐剂选自Proclin300...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子樵，李冬，
申请(专利权)人：蓝怡科技集团股份有限公司，浙江蓝怡医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31